显微镜

显微镜现在的光学显微镜可把物体放大1600倍，分辨的最小极限达0.11微米，国内显微镜机械筒长度一般是160毫米。显微镜系统中共轭距是物镜物方焦点到目镜物方焦点的距离。物镜通过转换器旋转式接到镜筒的下端面目镜以插入式接镜筒的上端面应满足齐焦要求：调换物镜后，不需再调焦就能看到像。a.物镜调换后，像面不动，物面不动——物镜共轭距不变（195mm)b.物镜像面即目镜前焦面不动——物镜像面在上端面以下10mm处c.机械筒长——上下端面之间的距离（160mm），有的显微镜机械筒长可调调换物镜（目镜）后微调焦不可避免，故还必须有微动机构具有中间实像面，可放置分划板，用于测量（构成测微目镜）当中间实像A’位于Fe之前时，A”为实像，可投影到屏上。也可用图像传感器接收实像，构成电子目镜。物镜是显微镜最复杂和最重要的部分，在宽光束中工作（孔径大），但这些光束与光轴的倾角较小（视场小）；目镜在窄光束中工作，但其倾角大（视场大）.当计算物镜与目镜，在消除象差上有很大差别。成像原理显微镜主要由目镜和物镜来进行成像，它们都是凸透镜，焦距不同。物镜的凸透镜焦距小于目镜的凸透镜的焦距。物镜相当于投影仪的镜头，物镜成像规律：fu2f，成放大倒立实像；目镜相当于普通的放大镜，目镜成像规律：uf，成放大正立虚像（注：这里的正立是相对于物镜所成的像）故最后成出来的像是倒立放大的。光学显微镜是根据凸透镜的成像原理，要经过凸透镜的两次成像。第一次先经过物镜（凸透镜1）成像，这时候的物体应该在物镜(凸透镜1）的一倍焦距和两倍焦距之间，根据物理学的原理，成的应该是放大的倒立的实像。而后以第一次成的物像作为“物体”，经过目镜的第二次成像。由于我们观察的时候是在目镜的另外一侧，根据光学原理，第二次成的像应该是一个虚像，这样像和物才在同一侧。因此第一次成的像应该在目镜（凸透镜2）的一倍焦距以内，这样经过第二次成像，第二次成的像是一个放大的正立的虚像。如果相对实物说的话，应该是倒立的放大的虚像。反光镜用来反射，照亮被观察的物体。反光镜一般有两个反射面：一个是平面镜，在光线较强时使用；一个是凹面镜，在光线较弱时使用，可会聚光线。显微镜由物镜和目镜组成。物体AB在物镜前焦面稍前处，经物镜成放大、倒立的实像A'B'，它位于目镜前焦面或稍后处，经目镜成放大的虚像，该像位于无穷远或明视距离处。对正常眼，位于上，显微镜光学筒长为。放大倍数显微镜包括两组透镜——物镜和目镜。显微镜的的放大倍数主要通过物镜来保证，物镜的最高放大倍数可达100倍，目镜的放大倍数可达25倍。物镜的放大倍数可由下式得出：M物=L/F1，式中：L——显微镜的光学筒长度（即物镜后焦点与目镜前焦点的距离）；F1——物镜焦距。而A′B′再经目镜放大后的放大倍数则可由以下公式计算：M目=D/F2，式中：D——人眼明视距离（250mm）F2——目镜焦距。显微镜的总放大倍数应为物镜与目镜放大倍数的乘积，即：M总=M物×M目=250L/F1*F2。显微镜的放大倍数是由目镜、物镜和镜筒的长度所决定的，显微镜目镜长度与放大倍数呈负相关，物镜长度与放大倍数呈正相关，即目镜长度越长，放大倍数越低；物镜长度越长，放大倍数越高。一般的物镜配置是4倍、10倍、40倍、100倍，目镜常规配置是10倍，另外还有16倍、20倍等。F数F数就是f/d,f为焦距，d为入射光瞳直径，为相对孔径的倒数，决定了像面照度，决定了设计的难度，光学设计还有：1像空间F数：计算无穷远共轭点时的轴上有效焦距与近轴入瞳孔径的比值。2近轴F数：就是忽略了像差的有效f数。3工作F数：此F数比像空间F数有用，由于它基于镜头的实际共轭面的真实光线。不同类型的目镜，其视场数不同，倍率高的目镜，视场数小。视场数（一般简写为F.N.）以毫米为单位，定义为样品图像范围的目镜光阑尺寸，是通过目镜实际看到的光阑直径，即通过目镜能观察到的物体表面的实际范围（实际视场）（F.O.V），显微镜系统物方视场FN=目镜视场数FN/物镜放大率。一般来说，F.N.特指目镜，而非物镜。所以我们可以在目镜看到F.N.=22等等，意指目镜的视场直径为22mm。对于物镜，在国外文献中，一般提到视场，均指其像方视场——实际上就是目镜的物方视场——有时我们也称之为“中间像面视场”。所以，从这个意义上讲，F.N.其实是指中间像面而言。简单而言，传统显微镜的视场数在6-18左右（就常见的10×目镜而言）。目前来看，一般视场数超过18就可称之为大视场显微镜。国内很多产品已经超过20，大多国际产品在22左右。分辨率在明视距离（25cm）之处，正常人眼所能看清相距0.073mm（对应角度60’’）的两个物点，这个0.073mm的数值，即为正常人眼的分辨距离。显微镜的分辨距离越小，即表示它的分辨力越高，也就是表示它的性能越好。当用普通的中央照明法（使光线均匀地透过标本的明视照明法）时，显微镜的分辨距离为d=0.61λ/NA，式中d——物镜的分辨距离，单位nm，λ——照明光线波长，单位nm，NA——物镜的数值孔径，例如油浸物镜的数值孔径为1.25。可见光波长范围为400—700nm，取其平均波长550nm，则d=270nm，约等于照明光一半。一般地，用可见光照明的显微镜分辨力的极限是0.2μm，线波长一半。出瞳在望远镜和显微镜等目视光学仪器中，人眼的瞳孔必须与出瞳重合才能看到整个视场，为了避免眼睫毛与系统最后一面相碰而妨碍观察，出瞳距离不能小于一定的数值。实验室仪器或一般的普通仪器，要求最少的出瞳距离约为6mm；军用光学仪器中，考虑到加眼罩和带防毒面具，出瞳距离较长，一般为20mm左右。目视光学仪器的出瞳在外面，是在出射光线共同经过的最小的口径的位置。眼睛的瞳孔在此处时最容易让最多的光线进入眼睛。出瞳位置在目镜像方焦点Fe’稍后处，出瞳在总的像方焦点上，人眼瞳有可能与之重合，接收所有成像光。因为出瞳与整个系统的像方焦面重合，设像方孔径角为，因系统满足正弦条件即故即其中称数值孔径由放大率公式孔径光阑低倍物镜的孔径光阑——为单组物镜框本身；高倍物镜的孔径光阑——多组物镜的最后一组镜框，或在Fo’处专设孔阑。视场光阑通常在中间实像面上专设视场光阑，因此显微镜系统无渐晕，视场有清晰边界。假设物面上线视场为,则视阑直径为。理论上视阑直径越大，则物方线视场越大。实际上显微镜的视场都很小，因为大了以后不能给出满意的像质。显微镜的物镜通用显微镜物镜从物平面到像平面的距离称为共轭距，不论显微镜放大率如何，共轭距都是相等的。物镜的共轭距离分有限远和无限远两种。早期的共轭距均为有限远，一般统一为195mm。目前，国际上较为先进的显微镜都是无限远光路的，无限远物镜的共轭距离为∞。物镜共轭距的规定，是从低倍物镜到高倍物镜的共轭距不变，保证了显微镜从低倍到高倍时仍能保持清晰的物像。在一架显微镜上，通常都配有若干个不同倍率的物镜目镜供互换使用。为了保证物镜的互换性，要求不同倍率的显微镜物镜的共轭距离（物平面到像平面的距离）相等。各国生产的通用显微镜物镜的共轭距离大约为190mm左右，我国规定为195mm。这也要求各物镜的齐焦距离相同，目前统一为45mm。随着放大倍数由低到高，其结构也相应复杂。低倍物镜可以用双胶合，中倍物镜用双双胶合，高倍物镜用双胶合＋前片，数值孔径更大的阿贝物镜则需要浸油。10×0.25物镜20×0.4物镜40×0.65复消色差物镜60×0.8物镜100×1.3浸水物镜50×0.6折反射UV物镜计算物镜焦距设物镜的物距为-l，像距为l’，已知共轭距L=195mm，放大率为=-10，则'll，l’-l=L，可求出'1Ll，又由''''1'''xlflfff得出2''1(1)lLf。工作距离PLL5X/0.1工作距离：17.9mmPLL10X/0.25工作距离：20.2mmPLL20X/0.40工作距离：8.80mmPLL50X/0.70工作距离：3.68mmPLL100X/0.85（干镜Dry）工作距离：0.40mm以上工作距离是长工作距离物镜的，还有普通物镜的，普通物镜比这个长工作距离的要再小些。数值孔径数值孔径表征物镜的聚光能力，是物镜的重要性质之一，通常以“NA”表示。物镜的数值孔径大小决定了物镜的分辨能力（鉴别）及有效放大倍数。根据理论推导得出：NA=nsinθ。数值孔径UnNAsin是显微镜物镜最主要的光学特性，它决定了物镜的衍射分辨率，根据显微镜物镜衍射分辨率的计算公式：NA61.0公式中，代表显微镜物镜能分辨的最小物点间隔；为光的波长，对目视光学仪器来说，取平均波长nmmm5000005.0；NA为物镜的数值孔径。因此要提高显微镜物镜的分辨率，必须增大数值孔径NA。在明视距离（250mm）处，正常人眼所能看清，相距0.073mm（对应角度60’’）的两个物点，经过显微镜放大后对眼睛的视角取2’，则显微镜视角放大率02'250，由于显微镜的分辨距离00.61NA，可以求出数值孔径2'*2500.61NA。显微镜物镜的倍率、数值孔径NA、显微镜目镜的焦距目f与系统出射光瞳直径/D之间满足以下关系：目目＝250/NAfNAD式中，目为目镜的视放大率。为了保证人眼观察的主观亮度，出射光瞳直径最好不小于mm1。在一定的数值孔径下，如果目镜的倍率目越小，就要求物镜有更高的倍率，但是物镜的倍率越高，工作距离越短，这给显微镜的使用造成不方便，因此一般希望尽量提高目镜的倍率，但目镜由于受到出射光瞳距离的限制，焦距不能太小，通常目镜的最高倍率为15，因此物镜倍率越高，要求物镜的数值孔径越大。数值孔径NA与相对孔径之间近似符合以下关系：NAfD2/一个25.0NA的显微镜物镜21/fD，高倍率的显微镜物镜（不包括浸液物镜），其数值孔径最大可能达到95.0，其相对孔径可以达到2。相对孔径大，是显微镜物镜的一个特点。放大倍数物镜的放大倍数，是指物镜在线长度上放大实物倍数的能力指标。有两种表示方法，一种是直接在物镜上刻度出如8×、10×、45×等，物镜放大倍数公式为M物=L/f物，L是光学镜筒长度，L值在设计时是很准确的，但实际应用时，因不好量度，常用机械镜筒长度。机械镜筒长度是指从显微镜目镜接口处之直线距离。每一物镜上都用数字标明了机械镜筒长度。另一种则是在物镜上刻度出该物镜的焦距f，焦距越短，放大倍数越高。物镜系统设计及优化物镜是由若干个透镜组合而成的一个透镜组。物镜的结构复杂，制作精密，通常都由透镜组组合而成，各镜片间彼此相隔一定的距离，以减少像差。每组透镜都由不同材料、不同参数的一或数块透镜胶合而成。物镜一般位于显微镜筒的下方，接近所观察的物体，由8～10片透镜组成。其作用一是放大(给物体造成一个放大的实像），二是保证像的质量，三是提高分辨率。常用物镜可按放大率分为低倍(4×)、中倍(10×或20×)、高倍(40×)和油浸物镜(100×)。低倍（NA≤0.2与β≤10X），中倍（NA≤0.65与β≤40X），高倍（NA0.65与β40X）。物镜有许多具体的要求，如合轴，齐焦。齐焦既是在镜检时，当用某一倍率的物镜观察图像清晰后，在转换另一倍率的物镜时，其成像亦应基本清晰，齐焦距离是指，对准焦点时的物镜镜体定位面到物体表面的距离。ZEISSICCS光学系统齐焦距离是45mm。而且像的中心偏离也应该在一定的范围内，也就是合轴程度。齐焦性能的优劣和合轴程度的高低是显微镜质量的一个重要标志，它是与物镜的本身质量和物镜转换器的精度有关。组合使用的目的是为了克服单个透镜的成像缺陷，提高物镜的光学质量。显微镜的放大作用主要取决于物镜，物镜质量的好坏直接影响显微镜映像质量，它是决定显微镜的分辨率和成像清晰程度的主要部件，所以对物镜的校正是很重要的。显微物镜是一消球差系统。这意味着：就轴上的一对共轭点而言，消除了球差并且实现了正弦条件时，每一物镜仅有两个这种消球差点。因此，物体与像的计算位置的任何改变均导致像差变大。装在镜筒下端的旋