CHAPTER-7-分子克隆工具酶

分子克隆工具酶TheenzymesinthemolecularcloningChapter7Chapter7分子克隆工具酶1.限制性核酸内切酶(特异性切割)2.甲基化酶(DNA分子的甲基化)3.DNA聚合酶(合成DNA)4.其他分子克隆工具酶(细胞破壁、核酸纯化等)第一节限制性内切酶1.限制与修饰现象2.限制酶的发现命名：宿主属名第一个字母(大写)+种名头两个字母(小写)+菌株号+罗马序号一、限制与修饰the1stsuchenzymefoundEscherichiacoliSpeciescategoryR13strainHowtonamearestrictionendonuclease?EcoRI限制性内切核酸酶的命名名称属名种名株名序数来源菌株EcoRIEcoRIEscherichiacoliRHindIIIHindIIIHaemophilusinfluenzaeHindIIHindIIHaemophilusinfluenzaeHindIHindIHaemophilusinfluenzaeREBASE(TheRestrictionEnzymeDatabase)（93%）I（1%）III（1%）酶分子内切酶与甲基化酶分子不在一起三亚基双功能酶二亚基双功能酶识别位点4-6bp，大多数回文对称二分非对称5-7bp非对称切割位点在识别位点中或靠近识别位点无特异性，在识别位点外1000bp在识别位点下游24-26bp限制反应与甲基化反应分开的反应互斥同时竞争限制反应是否需要ATP否是是5‘内切酶3‘内切酶ds-DNA结构:切口,缺口,断口缺口(gap)切口(nick)断口(cut)3'HOP5'3'HOP5'1、限制酶识别序列的长度一般4-8bp，常见6bp，当识别序列为4或者6bp时，他们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每44=256和46=4096bp中会出现一个识别位点。2、限制酶识别序列的结构一般为回文对称结构EcoRI：GAATTCCTTAAG3、限制酶切割的位置：大多在内部，也有在外部二、限制酶识别的序列ConsideralinearDNAmoleculewith6copiesofGAATTC:itwillbecutinto7fragmentswhichcouldbeseparatedbythegelelectrophoresis.(Thelargestfragment)(Thesmallestfragment)digestionofaDNAfragmentwithendonucleaseEcoRI•Agivenmoleculewillgenerateacharacteristicseriesofpatternwhendigestedwithasetofdifferentenzymes.–e.g.thecombinationofEcoRI+HindIIIUseofmultipleREsallowsdifferentregionsofaDNAmoleculetobeisolated1、匹配黏端(matchedend)识别位点为回文对称结构，产生的末端为匹配黏端(黏性末端，cohesiveend)，形成的两个末端是相同的，也是互补的。2、平末端(Bluntend)在回文对称轴上同时切割DNA的两条链，则产生平末端。三、限制酶切割产生的末端(1)Restrictionenzymesdifferintherecognitionspecificity:targetsitesaredifferent.(2)Restrictionenzymesdifferinthelengththeyrecognized,andthusthefrequenciesdiffer.DifferencesofREs(3)RestrictionenzymesdifferinthenatureoftheDNAendstheygenerate:blunt/flushends(平末端),sticky/staggeredends(粘性末端).(4)Restrictionenzymesdifferinthecleavageactivity.DifferencesofREsstickyends(粘性末端)bluntends(平末端)RecognitionsequencesandcutsitesofvariousendonucleasesCleavageofanEcoRIsite.The5’protrudingendsaresaidtobe“sticky”becausetheyreadilyannealthroughbase-pairingtoDNAmoleculescutwiththesameenzyme许多限制酶切割DNA产生非对称突出端。当识别序列为非对称序列时，切割的DNA产物的末端是不同的，如BbvCⅠ，它的识别切割位点CC↓TCAGCGGAGT↑CG有些限制酶识别简并序列，其识别的序列中有几种是非对称的。如AccⅠ，它的识别切割位点如下，GT↓AT/CGACCATA/GC↑TG3、非对称突出末端(1)同序同切酶这些酶识别序列和切割位置都相同。HindⅡ与HincⅡ识别切割位点为GTY↓RAC(Y为C或T，R为A或G)HpaⅡ与HapⅡ识别切割位点为C↓CGGMobⅠ与Sau3AⅠ识别切割位点为↓GATC4、同裂酶(isoschizomer)：识别相同序列的限制酶称为同裂酶，但切割位点可能不同。(2)同序异切酶KpnⅠ和Acc65Ⅰ识别的序列是相同的，但它们的切割位点不同，分别为：KpnⅠ：GGTAC↓CAcc65Ⅰ：G↓GTACC4、同裂酶(isoschizomer)(3)“同功多位”许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。如EcoRⅠ识别和切割位点为G↓AATTCApoⅠ识别和切割位点为R↓AATTY后者可识别前者的序列。4、同裂酶(isoschizomer)(4)其它有些限制酶识别的序列有交叉。如在pUC系列质粒的多克隆位点中有一个SalⅠ位点（识别切割位点为G↓TCGAC），该位点也可被AccⅠ位点（识别切割位点为GT↓MKAC）和HincⅡ位点（识别切割位点为GTY↓RAC）切割。4、同裂酶(isoschizomer)5、同尾酶(isocaudarner)不同的限制酶切割DNA产生的末端是相同的，且是对称的，即它们可产生相同的黏性末端。BamHI:G↓GATCCBglII:A↓GATCT6、归位内切酶(homingendonuclease)内含子编码的内切酶。1、限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求。2、酶单位：在适合的缓冲液及温度下，在20μl反应体系中反应1h，使1μgDNA完全消化所需要的酶量。3、在设计PCR引物时，如果要在末端引入酶切位点，就需要考虑加上一些满足酶切要求的碱基数目。四、DNA末端长度对限制酶切割的影响对同一底物中的有些位点表现出偏爱性切割，导致其对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。1、酶切位点对酶的敏感性不同，2、在切割相同量的不同DNA时所需要的酶量是不同的。五、位点偏爱(sitepreference)1.缓冲液：pH、Mg2+、DTT、BSA2.反应温度：大多数37℃3.反应时间：1-2h4.终止酶切的方法：EDTA、加热、苯酚抽提去除蛋白、试剂盒纯化DNA。六、酶切反应条件在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列。1、引起星星活性的因素：甘油浓度过高，酶过量，离子强度低，pH过高等。2、抑制方法：减少甘油浓度，减少酶的用量，提高离子强度，降低pH，保证反应体系无有机溶剂等。七、星星活性(staractivity)部分切割双链DNA的酶也可以消化单链，但切割效率不同或降低。某些限制酶只切割双链DNA中的一条链，产生单链缺口，即切口酶，命名时在前面加上一个N。八、单链DNA的切割1、将产生的5’突出末端补平后，再连接可产生新的酶切位点。2、同尾末端的连接：不同的同尾酶切割DNA产生的末端再相互连接时，可产生新的酶切位点，同时原来的酶切位点消失。3、平末端连接产生新的酶切位点PvuII(CAG↓CTG)+EcoRV(GAT↓ATC)MboI:GATC九、酶切位点的引入1、外部因素(可预见和控制)反应条件、底物纯度、酶量、反应体积、反应时间等2、内部因素星星活性、底物甲基化和底物的构象(切割线性DNA和超螺旋DNA的活性差异)十、影响酶活性的因素第二节甲基化酶1、Dam甲基化酶在GATC序列中的腺嘌呤N6位置引入甲基。某些限制酶的识别位点含GATC序列，对Dam甲基化的DNA敏感，不能切割相应的序列。一般哺乳动物DNA不会在腺嘌呤N6上甲基化，因此不受影响。当需要在这些敏感位点完全切割DNA时，可利用dam－型E.coli扩增并提取DNA。一、甲基化酶的种类(methylase)2、Dcm甲基化酶。识别CCAGG或CCTGG序列，在第二个胞嘧啶C的C5位置引入甲基。受Dcm甲基化作用影响的酶有EcoRII(CCWGG)，但其同裂酶不受影响，因其切点不同。3、EcoKI甲基化酶，其识别位点少，识别AAC(N)6GTGC和GCAC(N)6GTT序列中A的N6位置。4、SssI甲基化酶，来源于原核螺原体，可使CG序列中的C在C5位置上甲基化。一、甲基化酶的种类(methylase)二、依赖于甲基化的限制系统1、E.coli：McrA，McrBC和Mrr，识别序列不同，但只识别经过甲基化的序列，都限制由CG甲基化酶(M.SssI)作用的DNA。McrA：限制HpaII甲基化修饰的位点。McrBC：限制两套半位点(G/A)m5C。Mrr：限制m6A。三、甲基化对限制酶酶切的影响1.修饰酶切位点主要使酶切位点甲基化，而不受限制性核酸内切酶的切割。2.产生新的酶切位点有些酶是依赖甲基化的限制酶，因此甲基化后可产生新的酶切位点。第三节DNA聚合酶DNApolymerase主要功能：催化DNA的合成真核生物五种：α、β、γ、δ、ε原核生物三种：DNA聚合酶I,II和III1、活性：大肠杆菌DNA聚合酶I为单链多肽，相对分子质量为109×103，有三种活性：5’－3’DNA聚合酶活性，5’－3’外切核酸酶活性，3’－5’外切核酸酶活性。交换反应：如果只有一种dNTP存在，3’－5’外切核酸酶活性将从3’-OH端降解DNA，然后在该位置发生一系列连续的合成和外切反应，直到露出与该dNTP互补的碱基。一、大肠杆菌聚合酶I(1)利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5’－3’外切核酸酶活性，可用切口平移法标记DNA，用作杂交探针。方法：在Mg2＋存在下用DNaseI处理双链DNA模板，产生少量切口，在切口处，利用DNA聚合酶I的5’－3’外切核酸酶活性使切口沿5’－3’平移，同时产生的切口可作为DNA聚合酶I催化合成DNA的引物。合成过程中，标记的dNTP不断加入到DNA链上，可作为杂交探针。2、大肠杆菌DNA聚合酶I的用途(2)用于cDNA克隆中第二链合成利用聚合酶活性。但已被淘汰，改用Klenow酶或反转录酶。(3)对3’－突出末端的DNA作末端标记利用交换反应。现改用T4或T7DNA聚合酶。2、大肠杆菌DNA聚合酶I的用途二、KlenowDNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I经蛋白酶裂解后，从全酶中除去5’－3’外切酶活性的肽段后的大片段肽段，其聚合活性和3’－5’外切酶活性不受影响，相对分子质量为76×103。可利用基因工程生产。(1)补平DNA的3’凹端。(利用DNA聚合酶活性，要加足够的dNTP，如带标记，则可进行末端标记)(2)抹平DNA的3’凸端。(3’-5’外切核酸酶活性，切除3’凸端，要加足够的dNTP。T4和T7DNA聚合酶可替代)(3)通过置换反应对DNA进行末端标记(4)随机引物标记(聚合酶活性)(5)其他用途，如测序，cDNA合成第二链。KlenowD