大肠杆菌K88相关产品的研制

大肠杆菌口服疫苗的研制汇报人:范群平生物制品实验室Whatisvaccine？广义的疫苗是为了预防、控制传染病的发生和流行而接种于机体的预防性生物制品。生物制品，是指用微生物或其毒素，人或动物的血清、细胞等制备的用来预防、诊断和治疗用的制剂。预防用的抗体制剂也可以归类为疫苗Whatisoralvaccine？口服疫苗，顾名思义，就是经“口”途径接种的疫苗，进一步来说是经过消化道途径进行接种的疫苗。Whychoosetheoralvaccine？首先，口服疫苗避免了注射疫苗造成的惊吓应激，有效保护了动物福利。其次，口服疫苗降低了养殖成本，例如人力成本、抗应激产品的成本。最后，对于许多经肠道和黏膜表面感染的致病微生物有较好的防御能力。口服疫苗具有巨大的市场前景！WhydowechoosetheE.Coli?之所以选择大肠杆菌作为研究对象，就是因为仔猪大肠杆菌病是猪的常见传染病之一，发病率、死亡率高达50%~100%，直接给猪场造成巨大的经济损失。治疗不及时，即使恢复也变成僵猪，影响仔猪的生长发育，造成饲料的浪费，间接影响猪场的经济效益。WhyistheK88?1、大肠杆菌的致病性取决于它在小肠的粘附、定植、增殖以及产生毒素的能力，粘附因子或纤毛决定细菌定植的能力，一旦发生细菌定植，就会快速增值并产生毒素从而导致腹泻的发生。2、经过流行病学调查，我们发现导致仔猪大肠杆菌病的的最主要的粘附因子就是3、K88几乎100%由蛋白质组成，具有较强的免疫原性。K88HowtopreventandtreattheE.Colidisease?最好的方法就是应用为此，根据仔猪免疫系统的发育情况，我们设计了两种抗体应用方案：一、早期直接抗体应用方案鸡抗猪产肠毒素大肠杆菌（K88）卵黄抗体的研制二、后期间接抗体应用方案携带猪源产肠毒素大肠杆菌(k88)抗原基因的口服乳酸菌疫苗的开发及应用抗体一、鸡抗猪产肠毒素大肠杆菌（K88）卵黄抗体的研制Whydowechooseyolkantibody（IgY）?1、抗体水平高卵黄抗体所含有的抗体滴度大于血清中的抗体滴度，作为饲料添加剂具有更高的免疫保护效率。2、稳定性高卵黄抗体具有很高的热稳定性，便于机械生产、加工。3、安全性高卵黄抗体可以用来防治相应的病原体引起的感染并且无药物残留、不产生耐药性。4、用途广泛纯化的卵黄抗体可以用来诊断疾病并且具有经济省时省力的特点。Researchmathods1、产肠毒素大肠杆菌（K88）菌株的分离鉴定以及扩大培养培养基+诱导剂37℃、220rpm24小时震荡培养名称猪大肠杆菌猪沙门氏菌培养基猪大肠杆菌培养基疫苗生产用猪沙门氏菌培养基疫苗生产用细菌计数2.5×109cfu/ml1×109cfu/ml表1：细菌计数结果2、经过SDS-page实验证明K88粘附素蛋白表达了以后，进行细菌计数，以保证有较高的细菌数来用于疫苗制备。3、疫苗的制备1、菌株的灭活在菌液浓度为1×109cfu/mL的细菌悬液中加入终浓度为3‰的甲醛溶液，37℃恒温振荡作用48h。2、灭活效果鉴定灭活苗12灭活前细菌计数109cfu/mL109cfu/mL灭活后细菌计数003、疫苗的乳化将配制好并高压灭菌的油相佐剂与灭活的菌液按照1:1的比例混合，并用匀浆仪乳化，乳化期间不定时抽样检测疫苗的乳化效果乳化好的灭活疫苗呈乳白色牛奶状，滴入清水中时不溶解，不扩散，不沉淀。4、预接种实验为了检验动物实验设计的科学性和可行性，避免设计不周造成浪费，我们设计了预实验。预实验证明以6×109cfu的量免疫效果最好，免疫鸡群一开始出现应激反应，采食量下降、精神抑郁，趴卧不起。接种一周后鸡群恢复正常，没有出现实验鸡只死亡。免疫170日龄待开产鸡，鸡群分为2组，每组100只，一组为对照组，一组为实验组。1、首免每羽注射1.0mL。2、两周左右进行二免，方法同初免，每羽注射1.5ml。3、四周后进行三免，方法同初免，每羽注射2.0ml。4、每周收集卵黄液，采用试管直接凝集法进行卵黄液中卵黄抗体效价的测定。5、免疫待开产鸡群，诱导免疫应答，产生高抗体水平的鸡蛋样品编号12345678910111213抗体效价（log2）3666.57.58989111010106、免疫鸡群的抗体效价变化表3：免疫鸡群大肠杆菌k88抗体效价免疫鸡群的抗体效价变化卵黄抗体曲线图02468101212345678910111213采样时间卵黄抗体效价以上结果表明：免疫蛋鸡在免疫后卵黄中的特异性抗体开始明显升高，10周达到高峰，并持续到13周。收集免疫鸡10~13周产的鸡蛋，进行喷干工艺的摸索，最后确定喷干时进口温度设定为160℃，出口温度设定为90℃，对卵黄抗体滴度无影响，并且易于操作。7、卵黄抗体的喷雾干燥指标色泽粒度粗蛋白消化率卵黄抗体粉初产品淡黄色80目12.6%97.6%8、卵黄抗体粉指标测定保存条件：常温下放置半年，卵黄抗体活性无影响。卵黄抗体喷干粉在生产上具有良好的加工和储存性能！表4：卵黄抗体指标9、小鼠造模饲喂试验5周龄小鼠饲养观察一周后无异常，直肠试纸检测ETEC阴性，感染前,停止喂食12h，腹腔注射0.2ml菌液，2h后正常喂食。对照组处理的不同之处是把菌液改为生理盐水。感染后对动物的观察:每隔3h观察1次，连续观察24小时并记录。表5：各实验组小鼠死亡情况10、k88卵黄抗体的断奶仔猪饲喂试验从表6可见，3个组日增重最好的为试验②组达169.72g，最差的为对照组131.94g，料重比最好的为试验②组1.48，最差的为对照组达1.92，试验①组介于两者之间。腹泻头次以试验①组为最小。对照组的腹泻率最高为16.49%显著高于2个试验组，这表明合用IgY对有效降低仔猪断奶后腹泻的发生，且在合理范围内随着剂量的增加其腹泻效果越好。但是综合料重比，腹泻造成的死亡率等数据来看，基础日粮+1%的k88卵黄抗体粉可以收到最佳的效果考虑到实际生产中，导致仔猪腹泻的情况较为复杂，不只是大肠杆菌K88粘附素，因此我们有做了进一步的工作调整，将携带K88、K99、987P、F41、F18菌毛抗原的几种大肠杆菌还有伤寒沙门氏菌联合在一起制成了大肠杆菌沙门氏菌二联5价卵黄抗体。二、携带猪源产肠毒素大肠杆菌(k88)抗原基因的口服乳酸菌疫苗的开发及应用实验一、重组乳酸菌的PCR鉴定及表达产物的SDS-PAGE和West-blot分析重组菌活化、增菌及质粒的提取鉴定PCR鉴定重组菌的诱导表达Western-blotSDS-PAGE免疫动物多克隆抗体的制备产毒素大肠杆菌疫苗的制备确定为携带诱导肽和抗原基因的重组乳酸菌技术路线1、重组乳酸菌的分子鉴定—PCR鉴定图1:重组乳酸菌核酸PCR分子鉴定M:DL2000；1、4、7:为重组乳酸菌核酸PCR扩增结果重组菌活化、增菌及质粒的提取鉴定PCR鉴定重组菌的诱导表达Western-blotSDS-PAGE免疫动物多克隆抗体的制备产毒素大肠杆菌疫苗的制备确定为携带诱导肽和抗原基因的重组乳酸菌2大肠杆菌和乳酸菌发酵产物免疫印迹（West-bloting）结果1M234M:低分子量蛋白marker;1:大肠杆菌(K88)发酵液；2、4:乳酸菌发酵上清液3:乳酸菌菌体沉淀样品18KD28KD45KD60KD100KD图4:大肠杆菌和乳酸菌发酵产物免疫印迹结果实验二、乳酸工程菌诱变选育及工业化生产条件的摸索重组菌的紫外诱变选育耐酸耐胆盐遗传稳定性检测培养基工业化配方的优化发酵条件的优化中试最佳培养基温度、转速等确定工业化生产最佳发酵条件遗传稳定性检测技术路线1重组乳酸菌的诱变选育1.1紫外诱变结果稀释度对照诱变时间菌落个数致死率10-7300120s6877.4%150s4884%180s2093%10-82790s774%120s966.7%150s966.7%10-90180s0结论：诱变结果表明，诱变数据符合诱变成功的前提条件，可以对存活的菌落进行选育。1.2、重组乳酸菌的选育以活菌下降对数值均小于2为标准，从17株乳杆菌中初步筛选出1株优良菌株，其耐酸和耐胆盐测定结果如表编号耐胆盐测定（log）耐酸(log)原液(log)耐胆盐对数差耐酸对数差1＜47.727.62＞2＜22＜47.827.67＞2＜23＜47.777.71＞2＜24＜47.787.78＞2＜255.017.757.7＞2＜265.117.597.69＞2＜27＜47.617.84＞2＜28＜47.577.61＞2＜294.697.77.72＞2＜210＜47.727.7＞2＜2114.487.697.68＞2＜212＜47.887.89＞2＜213＜47.987.98＞2＜214＜47.97.78＞2＜2156.147.587.53＜2＜2165.267.687.66＞2＜2174.887.797.76＞2＜22重组乳酸菌选育株对小鼠肠粘液的体外粘附实验名称活菌数（cfu/mL）原液活菌总数（cfu/mL）体外粘附率粘液11.63×1094.7×10964.2%粘液21.73×1094.7×10963.2%灌肠1.28×1094.7×10972.8%3选育株的遗传稳定性实验遗传稳定性0102030405012345678910传代数活菌数（亿）乳酸菌数量选育株传10代后，在红霉素培养基里的计数情况，表明遗传稳定性较好。重组菌的紫外诱变选育耐酸耐胆盐遗传稳定性检测培养基工业化配方的优化发酵条件的优化中试最佳培养基温度、转速等确定工业化生产最佳发酵条件遗传稳定性检测技术路线应用生产常用的发酵条件和培养基，没再单独进行优化实验，做好种子液后加到500L发酵罐中，发酵12h后，再转入5吨的发酵罐，每2h取一次样，进行乳酸菌计数和pH值的测定，并绘制生长曲线。1选育株的生长曲线测定2选育株的菌液PH值变化情况测定在5吨大罐中发酵时间以20小时为宜。实验三、重组乳酸菌作为口服疫苗对小鼠免疫指标的影响及免疫保护效果的研究小鼠实验进程一览9.10开始动物实验10.19处理第一批小鼠11.6处理第二批11.22处理第三批10.28-30号，连续三天灌胃，同时进行疫苗免疫9.24-26号，连续三天灌胃，同时进行疫苗免疫10.10-12号，连续三天灌胃，同时进行疫苗免疫11.14-16号，连续三天灌胃，同时进行疫苗免疫12.4攻毒试验12.17处理最后一批1小鼠脾脏指数（mg/kg）测定结果从结果可以看出，各实验组小鼠脾脏指数均高于对照组，且均差异显著（P0.05)；表明基因工程菌对动物脾脏生长发育具有一定的促进作用。2小鼠肠道内容物sIgA（mg/L）测定结果从四批实验结果可以看出，工程菌组sIgA含量均高于对照组、LP组，和疫苗组相比，sIgA的滴度持续维持高水平状态，表明工程菌产生的高水平sIgA抗体更加持久，而灭活疫苗产生高水平sIgA抗体维持时间较短，保护效力不如工程菌。组别第1批第2批第3批第4批生理盐水50.54±27.80a68.17±6.64b70.79±4.52a65.27±13.44aLP60.05±20.51a71.52±7.20b78.62±12.55ab83.50±19.25a疫苗组66.84±14.88a53.43±5.56a94.32±4.18b86.11±14.03a工程菌组94.02±26.62a98.32±4.94c91.86±9.11b90.45±6.57b3血清中大肠杆菌k88抗体含量的OD值测定结果（大肠杆菌包被）从上述结果可以看出，各实验组k88抗体含量均高于对照组，攻毒以后，实验组均产生了k88抗体，工程菌组可以持久产生高水平的k88抗体。4小鼠肠道内的乳酸菌和大肠杆菌计数结果（log2）而肠杆菌方面，连续三天灌服1010cfu/mL的大肠杆菌菌液，攻毒10天后杀死小鼠取小肠进行大肠杆菌计数，发现各组乳酸菌差异不大，但肠杆菌中疫苗组和工程菌组数量最低。对肠道的整体保护效果，大致如下：工程菌组疫苗组LP组生理盐水组。组别乳酸菌大肠杆菌生理盐水组8.94.17LP组8.535.11疫苗组8.834工程菌