第二章-RNA的结构和功能

第四节RNA的结构与功能StructureandFunctionofRNA¾RNA是DNA的转录产物。¾RNA与蛋白质共同负责基因的表达和表达过程的调控。¾RNA通常以单链线性形式存在，但是可以通过链内的碱基互补配对形成局部的双螺旋结构，进而形成三级结构。¾与DNA相比，RNA的种类、大小、结构以及稳定性表现出了多样化，这与它们的功能多样化密切相关。真核细胞内主要RNA的种类和功能种类细胞定位功能信使RNAmessengerRNA(mRNA)细胞核、细胞质、线粒体蛋白质的合成模板非均一核RNAheterogeneousnuclearRNA(hnRNA)细胞核成熟mRNA的前体转运RNAtransferRNA(tRNA)细胞核、细胞质、线粒体转运氨基酸核糖体RNAribosomalRNA(rRNA)细胞核、细胞质、线粒体构成核糖体非编码小RNAsmallnon-codingRNA(sncRNA)细胞核、细胞质参与hnRNA的剪接和转运、rRNA加工、基因表达调控等¾信使RNA(messengerRNA,mRNA)是合成蛋白质的模板。¾不均一核RNA(hnRNA)含有内含子(intron)和外显子(exon)。¾外显子是氨基酸的编码序列，而内含子是非编码序列。¾hnRNA经过剪切后成为成熟的mRNA。一、mRNA是蛋白质合成中的模板hnRNA内含子(intron)mRNA„mRNA成熟过程外显子(exon)¾从AUG开始，每三个核苷酸为一组编码了一个氨基酸，称为三联体密码(codon)。¾成熟的mRNA由氨基酸编码区和非编码区构成。¾5′-末端的帽子(cap)结构和3′-末端的多聚A尾(poly-Atail)结构。5'3'm7GpppAAA……An3'非翻译区5'非翻译区编码区AUGUAA„成熟的真核生物mRNAONNNNNH2OOCH3OHHHCH2HOPO-OOHNNNOH2NNOOHHHHCH2HOHOPOO-CH3PO-O5'2'3'5'„帽子结构:m7GpppNm（一）大部分真核细胞mRNA的5'末端都以7-甲基鸟嘌呤-三磷酸核苷为起始结构mRNA的帽结构可以与帽结合蛋白(capbindingprotein，CBP)结合。真核mRNA的5′-末端7-甲基鸟嘌呤核苷帽状结构及核糖甲基化真核生物的mRNA的3′-末端转录后加上一段长短不一的聚腺苷酸。（二）在真核生物mRNA的3'末端有多聚腺苷酸结构mRNA核内向胞质的转移mRNA的稳定性维系翻译起始的调控帽子结构和多聚A尾的功能一条完整的mRNA包括5′-非编码区、编码区和3′-非编码区。编码区包括起始密码子、编码氨基酸的序列和终止密码子。DNAmRNA蛋白转录翻译原核细胞细胞质细胞核DNA内含子外显子转录转录后剪接转运mRNAhnRNA翻译蛋白真核细胞（四）mRNA的成熟过程是hnRNA的剪接过程卵清蛋白mRNA的成熟¾转运RNA(transferRNA,tRNA)在蛋白质合成过程中作为各种氨基酸的载体,将氨基酸转呈给mRNA。¾由74～95核苷酸组成；¾占细胞总RNA的15%；¾具有很好的稳定性。二、tRNA是蛋白质合成中的氨基酸载体（一）tRNA分子含有稀有碱基¾含10%~20%稀有碱基，如DHU¾3′末端为—CCA-OH¾5′末端大多数为G¾具有TψCNNHNHNNOCH3CH3NNNHNNHCH2CHCCH3CH3NHNHOOHHHHNHNHSON,N二甲基鸟嘌呤N6-异戊烯腺嘌呤双氢尿嘧啶4-巯尿嘧啶稀有碱基tRNA中常见的稀有碱基¾tRNA具有局部的茎环(stem-loop)结构或发卡(hairpin)结构。（二）tRNA具有茎环结构tRNA的二级结构——三叶草形¾氨基酸臂¾DHU环¾反密码环¾TψC环¾附加叉„tRNA的倒L三级结构¾tRNA的3′-末端都是以CCA结尾。¾3′-末端的A与氨基酸共价连结，tRNA成为了氨基酸的载体。¾不同的tRNA可以结合不同的氨基酸。（三）tRNA的3′-末端连接氨基酸3′5′反密码子密码子mRNA酪氨酸UACGUAACC3′5′¾tRNA的反密码子环上有一个由三个核苷酸构成的反密码子(anticodon)。¾tRNA上的反密码子依照碱基互补的原则识别mRNA上的密码子。（四）tRNA的反密码子识别mRNA的密码子¾核蛋白体RNA(ribosomalRNA，rRNA)是细胞内含量最多的RNA(80％)。¾rRNA与核蛋白体蛋白结合组成核蛋白体(ribosome)，为蛋白质的合成提供场所。三、以rRNA为组分的核蛋白体是蛋白质合成的场所*rRNA的种类（根据沉降系数）真核生物5SrRNA28SrRNA5.8SrRNA18SrRNA原核生物5SrRNA23SrRNA16SrRNA（一）原核、真核rRNA分子质量不同核糖体的组成原核生物（以大肠杆菌为例）真核生物（以小鼠肝为例）小亚基30S40SrRNA16S1542个核苷酸18S1874个核苷酸蛋白质21种占总重量的40%33种占总重量的50%大亚基50S60SrRNA23S5S2940个核苷酸120个核苷酸28S5.85S5S4718个核苷酸160个核苷酸120个核苷酸蛋白质31种占总重量的30%49种占总重量的35%rRNA与核糖体蛋白质共同构成核糖体，是蛋白质生物合成的场所：为肽链合成所需要的mRNA、tRNA、多种蛋白因子提供了相互结合的位点和相互作用的空间环境。（三）rRNA参与组成的核糖体是蛋白质翻译的场所70Sribosome50Slargesubunit23SrRNA5SrRNA31proteins16SrRNA21proteins30Ssmallsubunit„大肠杆菌的核蛋白体¾RNA组学是研究细胞内snmRNA的种类、结构和功能。同一生物体内不同种类的细胞、同一细胞在不同时空状态下snmRNAs表达谱的变化，以及与功能之间的关系。四、snmRNA参与了基因表达的调控¾细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA，统称为非mRNA小RNA(smallnon-messengerRNAs,snmRNAs)。„snmRNAsz核内小RNAz核仁小RNAz胞质小RNAz催化性小RNAz小片段干涉RNA参与hnRNA的加工剪接„snmRNAs的种类„snmRNAs的功能„核酶某些小RNA分子具有催化特定RNA降解的活性，这种具有催化作用的小RNA亦被称为核酶(ribozyme)或催化性RNA(catalyticRNA)。¾siRNA是生物宿主对外源侵入的基因表达的双链RNA进行切割所产生的特定长度和特定核酸序列的小片段RNA。¾siRNA可以与外源基因表达的mRNA相结合，并诱发这些mRNA的降解。¾基于此机理，人们发明了RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术。„小片段干扰RNA核酸的理化性质与分离纯化第五节„原核生物基因表达的特异性五、核酸在真核细胞和原核细胞中表现了不同的时空特性一、核酸的分子大小™采用电子显微镜照相及放射自显影等技术，已能测定许多完整DNA的分子量。™噬菌体T2DNA的电镜像显示整个分子是一条连续的细线，直径为2nm，长度为(49±4)μm。由此计算其分子量约为1×108。™大肠杆菌染色体DNA的放射自显影像为一环状结构，其分子量约2×109。真核细胞染色体中的DNA分子量更大。™果蝇巨染色体只有一条线形DNA，长达4.0cm，分子量约为8×1010，为大肠杆菌DNA的40倍。™RNA分子比DNA短得多，其分子量只达(2.3～110)×104。二、核酸的溶解度与粘度™RNA和DNA都是极性化合物，都微溶于水，而不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。™它们的钠盐比自由酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达4%。™高分子溶液比普通溶液粘度要大得多，不规则线团分子比球形分子的粘度大，而线性分子的粘度更大。™粘度：DNARNAdsDNAssDNA™沉降行为:不同构象的核酸分子的沉降的速率有很大差异，这是超速离心法提取和纯化核酸的理论基础。三、核酸的酸碱及溶解度性质z核酸为多元酸，具有较强的酸性。核酸在波长260nm处有强烈的吸收，是由碱基的共轭双键所决定的。这一特性常用作核酸的定性和定量分析。四、核酸的紫外吸收„碱基的紫外吸收光谱¾DNA或RNA的定量A260=1.0相当于50μg/ml双链DNA(dsDNA)40μg/ml单链DNA(ssDNAorRNA)20μg/ml寡核苷酸¾确定样品中核酸的纯度纯DNA:A260/A280=1.8纯RNA:A260/A280=2.0„紫外吸收的应用五、DNA变性是双链解离为单链的过程在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。„定义DNA变性的本质是双链间氢键的断裂。协同性的DNA解链高温或极端的pH„DNA的变性„部分变性DNA的电镜图像¾增色效应(hyperchromiceffect)：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。„DNA解链时的紫外吸收变化„DNA的解链曲线连续加热DNA的过程中以温度相对于A260值作图，所得的曲线称为解链曲线。解链过程中，紫外吸光度的变化达到最大变化值的一半时所对应的温度。解链温度(meltingtemperature，Tm)¾G+C含量越高，解链温度就越高。„解链曲线的变化六、变性的核酸可以复性或形成杂交双链¾当变性条件缓慢地除去后，两条解离的互补链可重新配对，恢复原来的双螺旋结构，这一现象称为DNA复性(renaturation)。¾减色效应：DNA复性时，其溶液OD260降低。¾热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing)。¾不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。¾这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。„核酸分子杂交(hybridization)„核酸分子杂交¾研究DNA分子中某一种基因的位置。¾监定两种核酸分子间的序列相似性。¾检测某些专一序列在待检样品中存在与否。„核酸分子杂交的应用第六节核酸的提取与含量测定一、核酸的提取™提取核酸的一般原则是先破碎细胞;然后用蛋白质变性剂如苯酚或去垢剂(十二烷基硫酸钠)等，或用蛋白酶处理除去蛋白质;最后将所获得的核酸溶液用乙醇等使其沉淀。™在提取、分离、纯化过程中应特别注意防止核酸的降解。™为了防止内源性核酸酶对核酸的降解，在提取和分离核酸时，应尽量降低核酸酶的活性。™核酸的提取过程应在低温(0℃左右)以及避免剧烈搅拌等条件下进行。1、保持核酸分子结构的完整性；2、尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度；应尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间尽量避免各种有害因素对核酸的破坏核酸分离纯化的设计及原则核酸分子提取的技术路线I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中　核酸的释放细胞破碎的方法机械法高速组织捣碎机玻璃匀浆器研钵物理法超声匀浆器冻融法化学法自溶法酶处理表面活性剂处理法二、核酸的分离与纯化•1.层析法：羟甲基磷石灰和甲基清蛋白硅藻土柱层析•2.离心法：不同构象的核酸沉降速率不同•3.凝胶电泳：（1）电荷效应（2）分子筛效应应该清除的杂质主要包括三部分1、非核酸的大分子污染物：蛋白质、多糖及脂类物质等2、非需要的核酸分子：分离某一特定的核酸分子时，其它的核酸分子皆为杂质；3、加入的有机溶剂和某些金属离子核酸的浓缩、沉淀与洗涤•沉淀是浓缩核酸的最常用的方法•常用的盐类有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁•常用的有机溶剂则为乙醇、异丙醇和聚乙二醇•核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%～75%的乙醇洗涤去除二、技术路线的设计破碎细胞核酸从细胞中游离出来沉淀核酸除去蛋白质乙醇酚和氯仿核酸的提取过程DNA酚抽提法示意图一、酚抽提法基因组