5_大肠杆菌感受态细胞的制备、

实验四大肠杆菌感受态细胞的制备、重组DNA的转化、克隆筛选1.实验目的和要求通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。2.相关知识及原理感受态细胞(Competentcells):受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的细胞。（人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因）转化（transformation）：是将异源DNA分子导入受体细胞，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。转化的方法：1.化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞；2.电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。转化方法的实验原理热激法是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106～107转化子/µgDNA。电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中含有尽量少的导电离子。转化效率为109～1010转化子/µgDNA。克隆的筛选：主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素卡那霉素氯霉素四环素链霉素等将经过转化后的细胞在含抗生素培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。虽然只有那些含有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖，但对于连接混合物而言，此时并不能确定哪个克隆含有插入片段。？目录重组质粒克隆的鉴定鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有小规模制备质粒DNA进行酶切分析、插入失活、PCR以及杂交筛选的方法。最常用的方法是小规模制备质粒DNA进行酶切分析重组DNA转化细菌过程示意图3．仪器、材料和试剂无菌超净台，电热恒温水浴，分光光度计，离心机，移液器，微型离心管等；菌株：E.colijM109质粒：pUC+DNA片段的重组质粒LB培养基；含抗菌素的LB平板培养基（氨苄青霉素，终浓度100µg／mL)氨苄青霉素；母液200mg/ml预冷CaCl2溶液（0.1mol／L）4．操作步骤1）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)（1）从新活化的E.coliE.colijM109菌平板上挑取一单菌落，接种于3～5mlLB液体培养中，37℃振荡培养12h左右,将该菌悬液以1:100～1:50转接于100mlLB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600nm，至OD600nm≤0.5时停止培养；（2）每组取培养液1-4ml转入离心管中，在冰上冷却5min(可省略）,5000r／min离心2min（3）倒净上清培养液，用1ml冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴30min；（4）5000r／min离心2min；（5）弃去上清液，加入400µl冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心悬浮细胞。5000r／min离心2min；（6）弃去上清液，加入200µl冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；（7）制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。注意事项1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制）；2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3．经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；4．化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；5．所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；6．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA；7．一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；8.感受态细胞长时间处在常温状态，会严重影响到其转化率，因此应尽量减少常温操作，动作要迅速。9.为减少对细胞的机械损伤，操作时动作不能剧烈。2）细胞转化(1)分别取3个200µl感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作)，(2)第一组，转化实验组加入5µl重组质粒DNA+200µl感受态细胞第二组，感受态细菌对照组，加入200µl感受态细胞悬液；第三组，质粒DNA对照组1ng质粒DNA十200µl感受态细胞悬液。(2)将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置30min，于42℃水浴中保温1.5min，然后迅速冰上冷却2min(3)立即向上述管中分别加入0.6mlLB液体培养基（不需在冰上操作），使总体积到0.8ml，该溶液称为转化反应原液，摇匀后于37℃振荡培养约45min，使受体菌恢复正常生长状态3)平板培养（有时需要稀释）(1)取各样品培养液0.1ml，分别接种于含抗菌素LB平板培养基上，涂匀（如果用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫）。(2)菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37℃恒温培养箱内培养过夜(12-16小时)，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养用CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒DNA产生5106-2107个转化菌落。在实际工作中，每微克有105以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素：1.细胞生长状态和密度:不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。2.质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。3.试剂的质量:所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。4.防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。