第8讲目的基因的表达与调控

目的基因的表达与调控基因重组的主要目的是要使目的基因在某一细胞中能得到高效表达，即产生人们所需要的高产的目的基因产物，如蛋白质、多肽类生物药物。•基因工程技术的核心是基因表达技术。•基因表达是指结构基因在调控序列的作用下转录成mRNA，经加工后在核糖体的协助下又转译出相应的基因产物——蛋白质，再在受体细胞环境中经修饰而显示出相应的功能。•从基因到有功能的产物这整个转录、转译及所有的加工过程就是基因表达的过程，它是在一系列酶和调控序列的共同作用下完成的。基因表达在原核生物与真核生物中的差别•真核生物基因表达系统中，转录在核内进行，生成hnRNA，核内加工：剪接内含子和外显子，修饰5’和3’末端后形成成熟mRNA。而后在细胞浆中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖化、形成高级结构。•目前已构建出多种基因表达系统，包括原核生物表达系统和真核生物表达系统，不同的表达系统具有各自的特点。•原核生物基因表达以操纵子的形式进行;操纵子的调节基因与RNA聚合酶作用，结构基因开始转录成mRNA，同时，mRNA立即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录与转译近乎同时完成，mRNA随之被水解掉。本章主要内容•8.1基因表达的机制•8.2基因表达的调控元件•8.3外源基因表达系统8.3.1大肠杆菌基因表达系统（重点）8.3.2芽孢杆菌表达系统（了解）8.3.3链霉菌表达系统（了解）8.3.4蓝藻表达系统（了解）8.3.5酵母表达系统（自学）8.3.6哺乳动物细胞基因表达系统（自学）8.3.7植物细胞基因表达系统（自学）•8.4基因表达产物的检测与分离纯化•8.5基因工程的争论和安全措施8.1基因表达的机制•8.1.1外源基因的起始转录•外源基因转录起始的速率是基因表达的关键（限速）环节。•选择恰当的启动子（例如，可调控的启动子）和相关的调控序列，是构建一个高效表达系统的首要问题。原核生物启动子诱导型启动子：组成型启动子：如lac、trp、λPR、λPL、tac等的启动子如T7噬菌体的启动子真核生物启动子较复杂，可分为：诱导型、组成型和特异性启动子等类型8.1.2mRNA的延伸与稳定•外源基因起始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键。•涉及两个问题：1、要防止因转录物内的衰减和非特异性终止而诱发的mRNA转录的提前终止；2、要存在正常的转录终止序列以防止产生不必要的转录产物，使mRNA的长度限制在一定的范围内，从而增加外源基因表达的稳定性。8.1.3外源基因mRNA的有效翻译•外源基因mRNA有效翻译必须考虑的基本原则：•AUG(ATG)是首选的起始密码子。•SD序列为与核糖体16SrRNA互补结合的位点，该序列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基。•SD序列与翻译起始密码子之间的距离为3～9个碱基。•在翻译起始区周围序列不易形成明显的二级结构。不同基因组使用密码子具有选择性。主密码子（majorcodon）罕用密码子（rarecodon）•如果外源基因mRNA的主密码子与受体细胞基因组的主密码子相同或接近，则基因表达效率就高；否则，其表达效率就低。8.1.4表达蛋白在细胞中的稳定性•避免外源基因表达蛋白降解的对策：•构建融合蛋白表达系统•构建分泌蛋白表达系统•构建包涵体表达系统•选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统8.1.5目的基因沉默•基因沉默的作用机制基因在基因组中的位置对其表达的影响DNA水平上的基因调控RNA水平上的基因调控•位置效应的基因沉默：•转录水平的基因沉默：•转录后水平的基因沉默：8.2基因表达的调控元件•8.2.1启动子•启动子（promoter）：是一段提供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列，它位于基因的上游。RNA聚合酶通过与它的结合而启动基因的转录。•原核基因启动子具有－10和－35序列等结构元件，而真核基因启动子则具有TATA盒及上游元件等特征结构。•序列特异性•方向性•位置特性•种属特异性启动子的特征8.2.1.1原核生物的启动子•转录起始位点：多数细菌启动子转录起始区的序列为CAT，转录从第二个碱基起始，该碱基为嘌呤碱基（A/G）。•Pribnow框：－10bp处的TATA区（－10序列区）•Sextama框：－35bp处的TTGACA区（－35区）•间隔区：内部无明显的保守性，其序列长度比碱基组成对启动子的功能更重要。原核生物启动子序列特征示意图（Theprokaryoticpromoter）RNA聚合酶结合和起始转录的序列（ThesequenceofDNAneededforRNApolymerasetobindtothetemplateandaccomplishtheinitiationreaction）TTGACATATAATTranscriptionalstartsite5’3’-35-1016-19bp5-9bpT80A95T45A60A50T96T82T84G78A65C54A45CAT8.2.1.1真核生物的启动子Ⅰ型：rRNA基因启动子Ⅱ型：mRNA基因启动子Ⅲ型：tRNA基因启动子Ⅰ型启动子•所属基因编码的产物为rRNA前体，经剪切加工后成为各种成熟的rRNA分子。人体细胞Ⅰ型启动子核心启动子：紧邻转录起始位点，可以启动基因的转录。上游控制元件（UCE）：位于起始位点上游－180～－190bp处，它可以大幅度增强转录效率Ⅱ型启动子•转录起始位点•TATA框（Hogness框）：富含AT的保守序列区，它与DNA双链的解链有关，并决定转录起始点的选择。其中心点位于转录起始点上游－20～－30bp的位置•CAAT框：位于转录起始位点上游－75bp处，与RNA聚合酶的结合有关。•GC框：位于转录起始位点上游－100～－300bp处，与转录因子的结合有关。启动子基本区辅助区Ⅲ型启动子•内启动子：位于转录起始位点的下游，如tRNA和5SRNA的启动子。•外启动子：位于转录起始位点的上游，缺乏相应的内部序列。例如：脊椎动物U6核小RNA和7SKRNA启动子，结构类似于真核生物Ⅱ型启动子。8.2.1.3启动子与转录启动大肠杆菌RNA聚合酶的亚基成分亚基基因氨基酸含量数量分子量（kD）主要功能αrpoA329237与调节序列结合βrpoB13421151形成磷酸二酯键β′rpoC14071155与DNA模板结合σ70rpoD613170识别一般启动子，并启动合成RNA聚合酶：核心酶(α2ββ’)＋σ亚基＝全酶(α2ββ’σ)σfactor:8.2.1.4启动子的分离•随机克隆法•PCR扩增法待分离启动子的DNA分子酶切后，连接到含有缺启动子的报告基因的载体上，挑选阳性克隆子后进一步分析获得的含有启动子的片段。•聚合酶保护法•过滤膜结合法根据RNA聚合酶与启动子特异性结合的原理，取基因组文库中的重组质粒与RNA聚合酶在体外温浴一段时间，让RNA聚合酶与特异启动子序列结合。而后选择合适的限制性内切酶或外切酶消化重组质粒，以未加RNA聚合酶的DNA作对照。琼脂糖电泳分析酶切消化产物，被钝化的酶切位点或片段位于RNA酶保护区域内，即RNA聚合酶的结合位点，该位点可能含有启动子序列。进一步将该片段克隆到启动子探针质粒上，分析和检测启动子的转录活性。8.2.2增强子•增强子（enhancer）：是能够增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列，又称强化子。增强子的特性：•双向性。•重复序列。•增强子行使功能与所处的位置无关。•特异性。•增强子不仅与同源基因相连时有调控功能，与异源基因相连时也有功能。8.2.3终止子•本征终止子：不需要其他蛋白辅助因子便可在特殊的RNA结构区内实现终止作用。•依赖终止信号的终止子：要依赖专一的蛋白质辅助因子。①本征终止子•发夹结构(茎环结构)：延缓RNA聚合酶的运动，不终止RNA的合成，但为转录终止创造条件。•寡聚U组成的尾部：转录的终止信号。两大特征特征②依赖型终止子•终止位点上游50～90bp区域，是ρ因子的识别位点。ρ因子依赖型终止子也能形成茎环结构，但茎环的GC含量较低，因此RNA聚合酶在此移动的速度减慢，但停留时间较短，并且茎环结构的下游没有寡聚U结构，RNA聚合酶只能在ρ因子的协助下才能有效终止转录。•ρ因子是一个相对分子量为2.0×105的六聚体蛋白质分子，它能水解各种核苷三磷酸，实际上是一种NTP酶。由于它催化NTP的水解，ρ因子能促使新生的RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。•在RNA合成起始以后，ρ因子即附着在新生的RNA链上，靠ATP水解产生的能量，沿着5’-3’方向朝RNA聚合酶移动，到达RNA的3’－OH端后取代了暂停在终止位点上的RNA聚合酶，并从模板和酶上释放RNA，完成转录过程。•终止过程需要消耗能量，所以，ρ因子有终止转录和核苷三磷酸酶两种功能。8.2.4衰减子•衰减子（attenuator）：是位于mRNA分子前导序列中的一段控制蛋白质合成起始速率的调节区，亦即发生弱化作用的转录终止信号序列，又称弱化子。•衰减子最先发现于大肠杆菌色氨酸（trp）操纵子中。•trp前导区的4个片段（1、2、3、4）能以两种不同的方式进行碱基配对，有时以1-2和3-4配对，有时只以2-3配对。•在前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，所以前导肽的翻译对tRNATrp的浓度很敏感。当培养基中trp浓度很低时，负载有trp的tRNATrp也就少，这样翻译通过两个相邻trp密码子的速度就很慢，当4区被转录完成时，核糖体才进行到1区（或停留在两个相邻的trp密码子处），这时前导区结构是2-3配对，不形成3-4配对的终止结构，所以转录可继续进行，直到trp操纵子中的结构基因全部转录。而当trp浓度高时，核糖体可顺利通过两个相邻的trp密码子，在4区被转录之前，核糖体就到达2区，这样使2-3不能配对，3-4区可自由配对形成茎－环状终止子结构，终止转录。所以，弱化子对RNA聚合酶的影响依赖于前导肽翻译中核糖体所处的位置。大肠杆菌色氨酸（trp）操纵子中衰减子的作用8.2.5绝缘子绝缘子（insulator）：•既是基因表达的调控元件，也是一种边界元件；•它能阻止邻近的调控元件对其所界定基因的启动子起增强或抑制作用；•绝缘子抑制增强子的功能是有极性的。它只能抑制处于绝缘子所在边界另一侧的增强子的作用，而对处于同一结构域的增强子没有抑制作用；•绝缘子对基因表达的调控是一个非常复杂的过程，它是通过细胞内特定的蛋白质因子相互作用而产生调控效应的。8.2.6反义子•反义RNA（antisenceRNA）：同某种天然mRNA反向互补的RNA分子称为反义RNA，它是由双链DNA中的无意义链转录产生的，可以用来阻止被其转化的细胞中存在的与之互补mRNA的转译活性。（antisencetechology）。•反义子：编码反义RNA的DNA称为反义子。•反义子在DNA的复制、转录和翻译三个水平对基因的表达起调节作用，其中以对蛋白质合成的抑制最为普遍。复制水平的调节•直接抑制——反义RNA与引物RNA前体互补，使得引物RNA无法与DNA模板结合，进而抑制DNA复制的频率。•间接抑制——反义RNA通过阻断复制激活蛋白因子的合成而间接抑制DNA的复制。转录水平的调节•反义RNA通过与mRNA的5′端互补结合而阻止转录的延伸；•作用于mRNA的poly(A)区域，抑制mRNA的成熟及其运输；•与真核生物mRNA结合而影响其剪切加工。翻译水平的调节•通过与mRNA的5′端SD序列结合，改变其空间构象，从而影响核糖体在mRNA上的定位；•通过与mRNA的5′端编码区（如起始密码）结合，直接抑制翻译的起始。SD序列（SDsequence）：Shine-Dalgarno序列的简称，此为纪念最早发现该序列的研究者而命名的。它是原核生物中核糖体的结合位点，亦即存在于mRNA分子AUG起始密码子之前的多聚嘌呤序列AGGAGGG的部分或全部，可与16SrRNA的3′-末端序列互补。SD序列在核糖体同mRNA的结合过程中起重要作用。8.3外源基因表达系统•外源基因表达系统