第七组-plasmid

SectionHCloningvectorsH1DESIGNOFPLASMIDVECTORS第一部分课件制作：黄海舟讲解：刘阿瑞质粒（plasmid）：一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。质粒载体，在由限制性核酸内切酶修饰过的质粒DNA序列中插入外源的目的基因，以质粒为载体，将目的基因通过转化或转导的方法导进宿主细胞，进行重组、筛选、扩增的过程。所有的质粒载体都有三个共同特点：一个复制子：复制子是还有DNA复制起始位点的一段DNA（ori），也包括表达由质粒编码的复制必需的RNA和蛋白质的基因。一个选择性标志：选择性标志对于质粒在细胞内持续存在时必不可少的。一个克隆位点：克隆位点是限制性内切酶切割位点，外源性DNA可由此插入质粒内，而且并不影响质粒的复制能力，或为宿主提供选择性表型。质粒的基本特征：质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。1.是染色质外的双链共价闭合环形DNA可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2-300kb之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯化，＞15kb的大质粒则不易提取。2.能自主复制，是能独立复制的复制子（autonomousreplicon）。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代。按质粒复制的调控及其拷贝数可分两类：严紧控制（stringentcontrol）型质粒的复制常与宿主的繁殖偶联，拷贝数较少，每个细胞中只有1个到十几个拷贝；另一类是松弛控制（relaxedcontrol）型质粒，其复制宿主不偶联，每个细胞中有几十到几百个拷贝。3.质粒对宿主生存并不是必需的。这点不同于线粒体，线粒体DNA也是环状双链分子，也有独立复制的调控，但线粒体的功能是细胞生存所必需的。线粒体是细胞的一部分，质粒也往往有其表型，其表现不是宿主生存所必需的，但也不妨碍宿主的生存。pBR322(双抗生素质粒）质粒载体的结构pBR322是最早人工构建的质粒载体。通过将下面几部分不同来源的DNA片段连接起来而构成的环状质粒：1.来源于ColE1的衍生质粒pMB1的DNA复制起点(ori)及rop区；2.来源于质粒pSC101的四环素抗性基因(tetr)；3.来源于转座子Tn3的氨卞青霉素抗性基因(ampr)。pBR322质粒载体的结构可知其具有如下优点：（1）具有较小的分子量。经验表明，为了避免在DNA的纯化过程中发生链的断裂，克隆载体的分子大小最好不要超过10Kb。pBR322质粒这种小分子量的特点，不仅易于自身DNA的纯化，而且可容纳较大的外源DNA片段；（2）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号，能指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞以及外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子连接产物(Ligationproducts):克隆过程中最重要的步骤之一就是鉴别幻化载体分子与重组质粒，已形成了许多方便于鉴别的方法。将目的基因与质粒载体连接时，最常见的非目标产物就是现性载体片段自身环化所形成的空质粒载体。自身环化载体可通过从转化克隆中小量提取质粒，然后酶解及随后的琼脂糖凝胶电泳分析来与重组体相区分。AEB蓝白颜色筛选：•最常用的大肠杆菌克隆用质粒pUC19的图谱，此质粒的复制起点处序列经过改造，能高频率起动质粒复制，使一个细菌pUC19的拷贝数可达500-700个；质粒携带一个抗氨芐青霉素基因，编码能水解β-内酰胺环，从而被坏氨芐青霉素的酶，当用pUC19转化细菌后放入含氨芐青霉素的培养基中，凡不含pUC19者都不能生长，结果长出的细菌就是都含有pUC19的；pUC19还携带细菌lac操纵元中的lacI和lacZ基因编码，β-半乳糖苷酶N端状146个氨基酸的段落，当培养基中含有诱导物IPTG和Xgal时，lacz'基因被诱导表达产生的β-半乳糖苷酶N端肽与宿主菌表达的C端肽互补而具有β-半乳糖苷酶活性（质粒和宿主编码的肽段各自都没有酶活性，两都融为一体而具酶活性，称为α-互补，α-complementation），半乳糖苷酶水解Xgal而使菌落呈现蓝色；在lacz'中间又插入了一段人工设计合成的DNA序列，其中密集多个常用的限制性核酸内切酶的位点，使外来的基因和序列能很方便地被插入此位置，当外来序列插入后则破坏了lacz'编码的半乳糖苷酶活性，生长的菌落就呈白色，这种颜色标志的变化就很容易区分和挑选含有和不含有插入序列或基因的转化菌落，称为蓝白筛选法。氨苄青霉素/X-gal平板amprOrilacZ’lacpromoterMCSpUC18第二部分课件制作及讲解：胡婵娟H1DesignofPlasmidVectors◎Ligationproducts◎Twinantibioticresistance◎Blue-whitescreening◎Multiplecloningsites◎Transcriptionofclonedinserts◎Expressionvectors分子克隆技术targetgenecloningvectorMultiplecloningsites(MCS)多克隆位点•Definition:ThepUCseriescontainanengineered(工程化的)lacZ‘gene,whichhasmultiplerestrictionenzymesites(限制性酶切位点)withinthefirstpartofthecodingregion(编码区)ofthegene,whichisknownas“MCS”.•多克隆位点:是包含多个（最多20个）限制性酶切位点的一段很短的DNA序列。能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案，是基因工程中常用到的载体质粒的标准配置序列。•TheinsertionoftargetDNAinanyofthesesites,willinactivates（使失活）thelacZ’gene,togiveawhitecolony(菌落).clongvector克隆载体•一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：•（1）分子量小、多拷贝、松弛控制型；•（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；•（3）能插入较大的外源DNA片段；•（4）具有容易操作的检测表型。•常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如pBR322、pUC系列、pGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。pUC质粒载体•pUC载体是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个在其5′-端带有一段多克隆位点的lacZ′基因，而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。•（1）pUC质粒载体的结构•一种典型的pUC系列的质粒载体，包括如下四个组成部分：（i）来自pBR322质粒的复制起点（ori）；（ii）氨苄青霉素抗性基因（ampr），但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的单识别位点；（iii）大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ‘）的启动子及其编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ′基因；（iv）位于lacZ′基因中的靠近5′-端的一段多克隆位点（MCS）区段，但它并不破坏该基因的功能。••(2）pUC质粒载体的优点•第一，具有更小的分子量和更高的拷贝数如pUC8为2750bP，pUC18为2686bP。pUC8质粒平均每个细胞即可达500～700个拷贝。•第二，适用于组织化学方法检测重组体pUC8质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ′基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用。因此，在应用pUC8质粒为载体的重组实验中，可用Xgal显色的组织化学方法一步实现对重组体转化子克隆的鉴定。•第三，具有多克隆位点MCS区段pUC8质粒载体具有与M13mp8噬菌体载体相同的多克隆位点MCS区段，它可以在这两类载体系列之间来回“穿梭”。因此，克隆在MCS当中的外源DNΑ片段，可以方便地从pUC8质粒载体转移到M13mp8载体上，进行克隆序列的核酸测序工作。同时，也正是由于具有MCS序列，可以使具两种不同粘性末端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片段，无需借助其它操作而直接克隆到pUC8质粒载体上。pGEM系列•pGEM质粒系列是与pUC系列十分类似的小分子载体。总长度为2743bp，含有一个氨苄青霉素抗性编码基因和一个lacZ'编码基因。在后者还插入了一段含有EcoRⅠ、SacⅠ、KpnⅠ、AvaⅠ、SmaⅠ、BamHⅠ、XbaⅠ、SalⅠ、AccⅠ、HindⅡ、PstⅠ、SphⅠ和HindⅢ等的多克隆位点。此序列结构几乎与pUCl8克隆载体的完全一样。•pGEM系列与pUC系列之间的主要差别是，它具有两个来自噬菌体的启动子，即T7启动子和SP6启动子，它们为RNA聚合酶的附着提供特异性识别位点。由于这两个启动子分别位于lacZ'基因中多克隆位点区的两侧，若在反应体系中加入纯化的T7或SP6RNA聚合酶，便可以将已经克隆的外源基因在体外转录出相应的mRNA。质粒载体pGEM-3Z和pGEM-4Z在结构上基本相似，两者之间的差别仅仅在于SP6和T7这两个启动子的位置互换方向相反而已。•MCS中，每个限制性酶切位点通常是唯一的，即它们在一个特定的载体质粒中只出现一次。生物技术学家可以轻而易举的将一个或多个外源DNA片段插入到多克隆位点所在的区域中，为构建基因改造生物，或者说转基因生物奠定基础。常见的基因工程载体都具有多克隆位点，有些载体，如λEMBL4、Charon40等甚至有两个。Transcriptionofclonedinserts(已克隆插入片段的转录）•Apromoter（启动子）withinthevectormaybeusedeitherinvivoorinvitrototranscribe（转录）aninsertedfragment(插入片段）.Somevectorshavetwospecificpromoters（特异启动子）toallowtranscriptionofeitherstrandoftheinsert.•Definition:能使插入基因进入宿主细胞表达的克隆载体，包括原核表达载体和真核表达载体，可以是质粒、噬菌体或病毒等。典型的表达载体带有能使基因表达的调控序列，并在适当位置有可插入外源基因的限制性内切酶位点。•分为四部分：目的基因、启动子、终止子、标记基因。•常用细菌质粒进行构建，构建过程中运用限制性核酸内切酶切割出与目的基因相合的末端（多为黏性末端，也有平末端），采用DNA连接酶连接，导入生物体实现表达。标记基因可帮助识别质粒并检测是否成功整合到染色体DNA中。Expressionvectors表达载体•表达载体（Expressionvectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），使目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。RBS---核糖体结合位点？？