基因工程-第一章-核酸的制备

Chapter1Preparationofnucleicacid核酸：遗传信息的储存物质脱氧核糖核酸：deoxyribonucleicacid,DNA核糖核酸：ribonucleicacid,RNA区别：第一节天然DNA的制备（PreparationofDNA）一、DNA的组成与结构（CompositionandStructureofDNA）:Aphosphategrouplinkedbyaphosphodiesterbondtoapentose(afive-carbonsugarmolecule)thatinturnislinkedtoanitrogen-andcarbon-containingringstructurecommonlyreferredtoasa“base”.BasePentosePhosphateGroupNucleotide主要碱基的化学结构：结构：DNADNA解链温度（Tm，meltingpoint）DNA分子杂交(HybridizationofDNAstrandsfromdifferentsources)环状DNA（CircularDNA）超螺旋DNA（supercoiledDNA，SC-DNA）；共价闭合环状DNA（CovalentlyclosedcircularDNA，cccDNA）；开环DNA（opencircleDNA，oc-DNA）；线形DNA（linearDNA，L-DNA）二、天然DNA的提取（PurificationofDNA）(一)生物材料的准备（PreparationofMaterial）：1.DNA的保存：1.1.70%的乙醇（Ethanol）1.2.TE溶液（Tris-Cl10mmol/LpH8.0，EDTA1mmol/L）1.3.低温2.大肠杆菌（E.coli）常见抗生素（Antibiotics）的使用：2.1氨苄青霉素（ampicillin，Ap）：抑制细菌细胞壁肽聚糖的合成，50～150μg/mL（水溶液）；2.2链霉素（streptomycin，Sm）：与细菌核糖体30S亚单位结合，抑制细菌蛋白质(酶)的合成,使细菌不能正常生长或者代谢而死亡，25～50μg/mL（水溶液）；2.3四环素（tetracycline，Tc）：与细菌核蛋白体的30S亚单位结合，干扰核糖体上密码子与反密码子的相互作用，从而阻止氨酰基tRNA同核蛋白体结合，5mg/mL（乙醇溶液）；2.4氯霉素（chloramphenicol，Cm）：与细菌核蛋白体50S亚基结合，抑制肽酰基转移酶，从而抑制蛋白质合成，20μg/mL（乙醇溶液）；2.5卡那霉素（knamycin，Km）：与细菌核蛋白体蛋白基结合，并与较小的RNA亚基编译区的特定碱基结合，从而抑制蛋白质合成，25～50μg/mL（水溶液）；(二)裂解细胞（Celllysis）：1.化学方法：1.1CTAB裂解法：CTAB（cetyltriethyammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），阳离子去污剂，与核酸形成复合物，在高盐溶液（＞0.7mol/LNaCl）中稳定，在低盐溶液（≤0.3mol/LNaCl）中沉淀。1.2SDS裂解法：SDS（sodiumdodecylsulfate，十二烷基磺酸钠），阴离子去垢剂，蛋白质变性剂，有效沉淀多糖，与K离子形成絮状沉淀，广泛用于质粒（plasmid）DNA的提取，蛋白质的分离纯化。2.酶裂解方法：2.2蛋白酶K（ProteinaseK）裂解法：用于水解蛋白质，特别是与DNA结合紧密的组蛋白（Histone），广泛用于动物组织基因组DNA的提取，通常与SDS，Tris-Cl及EDTA共同裂解细胞。2.3溶菌酶（lysozyme）裂解法：通常用于细菌裂解，提取质粒DNA，其原理是破坏细菌细胞壁的肽聚糖支架，通过低渗透压使细胞胀裂，引起细胞裂解。作用条件温和，pH6.0～7.0，室温25℃。（三）DNA的分离和抽提1.酚-氯仿抽提法：苯酚（phenol）-氯仿（chloroform）-异戊醇（isoamylalcohol）比例：25:24:1，苯酚：蛋白质变性剂；氯仿：蛋白质变性剂；并使变性的蛋白质从水相层分离；异戊醇：防止产生泡沫。2.氯化铯密度梯度离心法(CsCldensitygradientcentrifugation)；3.固相萃取法(solidphaseextraction,SPE)；离心技术在基因工程中的应用（ApplicationofCentrifugationtechniques）（四）DNA的纯化（purification）和浓缩（condense）1.DNA的纯化：1.1Rnase处理，去除RNA；1.2离子交换层析法；1.3氯化铯密度梯度离心法；1.4琼脂糖电泳洗脱法；琼脂糖电泳（Agarosegelelectrophoresis）1.安放好制胶模具（梳子和胶槽）2.琼脂糖凝胶浇灌并冷凝3.移走梳子，暴露出上样孔4.琼脂糖胶放置在电泳缓冲液中5.上样，通电流，直至DNA迁移到适当位置6.在紫外光（UV）下观察DNA电泳情况DNA电泳完毕后的琼脂糖凝胶在紫外光（UV）下观察DNA电泳情况不同凝胶的DNA电泳情况琼脂糖凝胶（agarose）聚丙烯酰胺凝胶凝胶（PAGE）电泳仪（电源和电泳槽）离子交换柱层析纯化DNA2.DNA的浓缩：2.1乙醇（Ethanol）沉淀法；2.2正丁醇（butylalcohol）抽提法；2.3聚乙二醇（PEG6000）浓缩法；第三节人工合成核酸片段二、核酸的酶法合成PCR反应（PolymeraseChainReaction,聚合酶链式反应）：模仿细胞内发生的DNA复制过程，在体外有酶催化合成特异性DNA片段。PCR技术简史1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……PCR技术简史1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖1.PCR的基本原理(MechanismofPCR)类似于DNA的体内复制。其原理是通过高温变性模板、引物与模板退火、引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以几何级数倍增。5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555Cycle3555555555555555525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。（3）PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚CPCR反应标准的PCR反应条件：10X缓冲液（Buffer）10μL4种dNTP混合物各200umol/L引物（Primer）各10～100pmol模板DNA（Template）0.1～2μgTaqDNA聚合酶0.5～2.5UMg2+1.5mmol/LPCR反应70-75℃90-94℃37-60℃PCR循环1234522557294时间（min）温度（℃）PCR反应适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍37-60℃90-95℃70-75℃PCR扩增No.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget12243841653266420220=1,048,57630230=1.07X1071cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128AmpliconPCR反应特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，2～4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA（1）TaqDNA聚合酶（2）PwoDNA聚合酶（3）TthDNA聚合酶（4）C.therm聚合酶4.2.1耐热性DNA聚合酶（1）TaqDNA聚合酶1986年从一种75℃热泉中的细菌(Thermusaquaricus)中分离纯化出来的。95kDa，单分子酶，75℃活性最强。具有5’-3’合成活性和5’-3’外切活性,无3’-5’外切活性。95℃时半衰期为40分钟。启动PCR反应的能力很强，聚合速度快，在72℃的聚合速度为每秒30-100碱基。由于没有3'-5'外切活性，在扩增过程中有8.9-11x10-5的错配率。（2）PwoDNA聚合酶来自古细菌Pyrococcuswoesei，由德国宝灵曼公司开发（BM），90kDa，100℃的半衰期大于2小时，具有3’-5’外切活性，出错率低，使用较多的的且具有高保真度的PCR酶。（3）TthDNA聚合酶来自嗜热热细菌（Thermusthermophilus），由Promega公司开发成商品。94kDa，95℃的半衰期为20分钟。在Mg2+存在条件下以DNA为模板合成DNA，而在Mn2+存在下可以RNA为模板合成cDNA。因此可在高温下做RT-PCR（反转录PCR）反应，避免RNA反转录过程中形成的二级结构。（4）C.therm聚合酶来自Carboxydothermushudrogenoformans，以Mg2+为辅助因子的逆转录酶，最适温度适60-70℃，同时也具有3’-5’外切酶校对活性，用于RT-PCR反应。4.2.2靶DNA/模板单、双链DNA均可。纯度：不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。使用浓度：一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。其两端20-30bp序列用以一对引物的设计。①引物长度18～30bp，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。②避免引物内部或引物之间存在互补序列（3个碱基），避免序列内有较长的回文结构，减少引物二聚体的形成以及引物内部二级结构的形成。③G/C和A/T碱基均匀分布，G+C含量在40～60%之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。4.2.3PCR引物④引物3’末端碱基应与模板DNA严格配对，并且3’末端为G、C时引发效率较高。⑤引物5’末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和表达。⑥引物用核酸序列保守区内设计并具有特异性，引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。4.2.4PCR原材料dNTP脱氧核苷三磷酸四种dNTP浓度应相等要求：浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量4.2.5PCR缓冲液成分：10mmol/LTris-HCl(pH8.8室温下)，50mmol/LKCl，1.5mmol/LMgCl2。Mg2+：是DNA聚合酶的激活剂，0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过