脓毒症实验动物模型CLP与CASP进展

·源远源摇摇·中华实验和临床感染病杂志（电子版）圆园员园年员员月第源卷第源期悦澡蚤灶允耘曾责悦造蚤灶陨灶枣藻糟贼阅蚤泽（耘造藻糟贼则燥灶蚤糟耘凿蚤贼蚤燥灶），晕燥增藻皂遭藻则圆园员园，灾燥造源，晕燥援源·综述·脓毒症实验动物模型悦蕴孕与悦粤杂孕进展缪鹏摇郁正亚摇摇脓毒症是一种由感染引起的临床综合征，通常导致全身一系列炎症反应，后期病死率较高，在世界范围内加重了卫生资源的负担。脓毒症有源个分期：全身炎症反应综合征（杂陨砸杂）、脓毒症、严重脓毒症以及脓毒症休克。脓毒症后期主要表现为全身器官衰竭（尤其在严重脓毒症期），最终导致难以逆转的循环衰竭（脓毒症休克）。肺、胃肠道、泌尿生殖道以及血液循环感染是绝大多数脓毒症患者的初始感染灶［员］。脓毒症炎症状态存在两种截然不同的免疫反应现象：杂陨砸杂特点是产生过多促炎介质因子，使机体早期处于高炎症反应状态，而随后发生的代偿性抗炎症反应综合征（悦粤砸杂）则使机体逐渐转入低炎症反应状态。当杂陨砸杂发展到悦粤砸杂过程的某一阶段时，机体内促炎介质因子和抗炎介质因子可达成某种平衡，称为混合型炎症反应综合征（酝粤砸杂）［圆］。杂陨砸杂与悦粤砸杂失衡或扩大化，均会导致宿主发生过度炎症反应，或因免疫功能抑制而受到间接伤害［猿］。为更好的研究脓毒症发病机制与治疗措施，现已设计出多种与脓毒症发病类似的动物模型。其相似点是尽可能模仿临床患者体内所出现的病理变化［猿］。其优点在于可控性强，实验中变量因素少，可以选择性在不同条件下更好地观察免疫、循环、代谢等变化［源］。脓毒症患者最常见的感染源来自腹腔且易造成腹腔内感染，因此腹腔感染模型是目前最常采用的脓毒症动物模型［缘］。鼠类盲肠结扎穿孔（悦蕴孕）与腹腔持续置管引流（悦粤杂孕）是临床研究脓毒症常用的两种模型，均模仿腹腔脓毒症感染的临床过程，引起多菌群感染，最终导致杂陨砸杂［远］。一、脓毒症动物模型的特点匀怎遭遭葬则凿等［源］指出理想的脓毒症动物模型应具备以下标准：脓毒症动物存在毒血症、细菌血培养呈阳性；动物模型表现出特征性代谢及生理学紊乱，脓毒症感染超过一定时间使动物机体内产生相应反应；同时该动物模型成本小，重复性好，见表员。国内学者提出脓毒症动物模型应包括有脓毒症典型的高排低阻血流动力学表现和高代谢状态；伴发多个器官功能障碍；有较高的自然病死率；出现器官功能障碍及动物死亡距脓毒症模型制备应有一定的时间间隔［缘］。近年来随着科学技术的发展，不同种属的动物被应用到研究中。小型哺乳动摇摇阅韵陨：员园援猿愿苑苑辕糟皂葬援躁援蚤泽泽灶援员远苑源鄄员猿缘愿援圆园员园援园源援园员怨摇摇基金项目：国家自然科学基金面上项目（猿园愿苑圆源缘愿）摇摇作者单位：员园园苑猿园摇北京市，首都医科大学附属北京同仁医院普通外科摇摇通讯作者：郁正亚，耘皂葬蚤造：扎澡藻灶早赠葬赠怎岳赠葬澡燥燥援糟燥皂中华实验和临床感染病杂志（电子版）圆园员园年员员月第源卷第源期悦澡蚤灶允耘曾责悦造蚤灶陨灶枣藻糟贼阅蚤泽（耘造藻糟贼则燥灶蚤糟耘凿蚤贼蚤燥灶），晕燥增藻皂遭藻则圆园员园，灾燥造源，晕燥援源·源远缘摇摇·物如大鼠、小鼠或豚鼠多用于有关生存率的研究；大型哺乳动物，如猪、羊、狗和灵长类则适于观察发病过程和症状表现。此外，具有明确基因特征的同系繁殖动物，如内毒素耐受型和内毒素敏感型小鼠，已广泛用于研究脓毒症和感染的病理、生理变化，而特定基因敲除和转基因品系的动物则成为从分子水平揭示脓毒症发病机制和进行防治研究的重要工具［苑］。动物模型的年龄、性别、品系与生长环境也是在选择模型时值得考虑的因素。栽怎则灶遭怎造造等［愿］通过对同一品系不同年龄小鼠悦蕴孕模型比较发现，年老小鼠较年轻小鼠对悦蕴孕模型更为敏感，其生存率明显降低，且血浆细胞因子水平显著提升。在创伤出血等打击后，雌性小鼠的免疫反应较雄性小鼠低。比较悦缘苑月蕴远小鼠与月粤蕴月辕糟小鼠，感染更易于诱导前者出现栽澡员反应［怨］。运蚤葬灶噪等［员园，员员］报道脓毒症动物模型处于不同温度及压力下会影响体内免疫水平及脓毒症发展过程，其预后也不一样。近期研究表明，一些动物模型可以模拟出人类脓毒症免疫炎症和凋亡的特征表现。虽然还未对这些动物模型与临床的相关性进行评价，但可靠地模拟出人类脓毒症免疫系统的变化过程，将是今后建立动物模型的标准之一［员圆］。总之，对于不同的研究内容，选择合适的脓毒症模型至关重要。表员摇脓毒症动物模型评定标准脓毒症动物模型摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇评定标准早期脓毒症高血容量状态（循环阻力降低，心输出量升高，血压维持正常）；高代谢状态（糖异生增加，高胰岛素血症）晚期脓毒症低血容量状态（循环阻力降低，心输出量降低，导致低血压）；低代谢状态（低血糖，低胰岛素血症）摇摇注：共同存在于人类脓毒症与脓毒症动物模型但未经临床证实的特点为特殊细胞群的凋亡（树突状细胞、内皮细胞及上皮细胞）摇摇二、悦蕴孕模型悦蕴孕模型是用于研究脓毒症及脓毒症休克最广泛的一种模型。其原理是腹腔内感染形成腹膜炎，多重病原体感染导致杂陨砸杂、脓毒症、脓毒症休克甚至死亡。悦蕴孕模型的标准步骤主要参考砸蚤贼贼蚤则泽糟澡等［员猿］的报道，其方法是在盲肠近端处结扎，并用无菌针在已结扎盲肠远端贯通穿刺盲肠壁造成穿孔，粪便流入腹腔引起混合性细菌感染及坏死组织处炎症反应，动物模型很快出现典型脓毒症及脓毒症休克的表现。悦蕴孕模型模仿临床上阑尾炎穿孔或憩室炎穿孔的特点，并一直被认作是脓毒症研究动物模型的“金标准”。悦蕴孕模型不仅易于标准化，还可以引入多种不同变量，因此在实验室被广泛应用。悦蕴孕模型有直接的感染病灶，也可以通过外科手术复原。悦蕴孕模型被广泛应用的另一重要原因就是其多用途性，包括研究细胞功能紊乱、细胞因子分泌模式、性别辕激素的影响、组织动力学和凋亡程序等［源］。值得注意的是，悦蕴孕模型可以模仿人类脓毒症中不同阶段血液动力学及代谢的变化，选择性观察不同细胞群的凋亡过程及宿主免疫反应，为建立临床模型提供参考［猿］。在悦蕴孕脓毒症模型的研究过程中，有数据表明大鼠体内白细胞介素远（陨蕴鄄远）的表达与悦蕴孕导致的脓毒症和大鼠生存率有很大关联，这点与临床观察到的现·源远远摇摇·中华实验和临床感染病杂志（电子版）圆园员园年员员月第源卷第源期悦澡蚤灶允耘曾责悦造蚤灶陨灶枣藻糟贼阅蚤泽（耘造藻糟贼则燥灶蚤糟耘凿蚤贼蚤燥灶），晕燥增藻皂遭藻则圆园员园，灾燥造源，晕燥援源象相近。悦蕴孕模型建立远澡后陨蕴鄄远浓度即可发生变化，且与小鼠病死率相关［源］。此外，巨噬细胞炎症蛋白鄄圆（酝陨孕圆）、趋化因子运悦、悦蛋白及悦鄄反应蛋白可以作为悦蕴孕模型早期和晚期死亡的特异性指标［猿］。三、悦粤杂孕模型与悦蕴孕模型相似，悦粤杂孕模型也是一种用于脓毒症研究的实验室动物模型。悦粤杂孕模型的步骤多参考在葬灶贼造等［员源，员缘］的报道，其方法是通过将一固定管径的支架植入鼠的升结肠壁，使肠腔与腹腔相通，持续感染形成腹膜炎导致脓毒症、多器官衰竭，最终死亡。这种病理变化与临床上肠瘘的病理变化过程相仿，腹腔内有肠内容物漏出但基本观察不到明显的缺血坏死灶。因此，悦粤杂孕模型非常适用于基于此种病理过程的脓毒症研究［员远］。悦粤杂孕模型同样是一种鼠类腹腔内细菌感染的模型，重现了急性多重细菌感染的脓毒症性腹膜炎的发生、发展过程。菌血症最早可以在置管员圆澡后检出，蕴孕杂浓度在圆澡内升高。通过血浆中细胞因子水平的变化发现杂陨砸杂及悦粤砸杂均在悦粤杂孕模型形成感染性腹膜炎后迅速发展，置管猿澡后即可检出血浆促炎因子包括肿瘤坏死因子（栽晕云）、白细胞介素员（陨蕴鄄员）、白细胞介素员圆（陨蕴鄄员圆）、白细胞介素员愿（陨蕴鄄员愿）及血浆抗炎因子白细胞介素员园（陨蕴鄄员园）伴随性升高。悦粤杂孕模型中实验鼠肺提取物中存在大量栽晕云，但少有陨蕴鄄员园表达，肝脏提取物则相反，陨蕴鄄员园高表达而栽晕云低水平表达。耘皂皂葬灶怎蚤造蚤凿蚤泽等［员苑］证实悦粤杂孕鼠类模型中肝脏库弗细胞是产生陨蕴鄄员园的主要来源，同时提出肝脏库弗细胞在调控感染免疫反应中起重要作用。在悦粤杂孕模型中肺和肝脏的炎症基因表达主要是依靠栽蕴砸泽的信号配体酝赠阅愿愿。而缺乏酝赠阅愿愿基因片段的悦粤杂孕模型的脾脏中几乎观察不到炎症的变化。去除酝赠阅愿愿基因的悦粤杂孕模型中细菌防御机制未减弱，从而预防杂陨砸杂的产生，提高存活率。陨蕴鄄员圆责源园缺乏的大鼠较悦粤杂孕模型病死率更高。这些研究成果均表明脓毒症时免疫机制的变化与悦粤杂孕模型预后联系紧密。全身细胞因子的变化与悦粤杂孕模型中不同管径的支架管有关，但变化幅度均比悦蕴孕模型中要高。与临床腹膜炎患者相比，悦粤杂孕模型血浆栽晕云、陨蕴鄄远、陨蕴鄄员园水平均显著升高。以上证据表明杂陨砸杂和悦粤砸杂可能在不同部位同时发生［猿］。蕴怎泽贼蚤早等［员远］发现悦粤杂孕模型直到死亡前员澡体内病理生理变化与血液动力学变化均相对稳定，预示悦粤杂孕模型可以为研究脓毒症及其后期变化提供一个相对稳定的载体。四、悦蕴孕与悦粤杂孕模型比较悦蕴孕与悦粤杂孕模型模仿的是两种不同类型的疾病状态，提示悦粤杂孕模型侧重于弥漫性腹膜炎的病理变化，而悦蕴孕模型则更偏向于局限性腹腔脓肿形成的病理变化［远］。悦蕴孕与悦粤杂孕两种模型各有利弊，二者在影响因素、细胞炎症因子变化、细菌培养、预后因素及存活率等方面各有不同（表圆）。员援影响因素：悦蕴孕模型的影响因素有很多，包括动物年龄、性别、种系等。据报道，即使在相同实验室条件、同种实验设备操作下制备悦蕴孕模型，对比不同组中华实验和临床感染病杂志（电子版）圆园员园年员员月第源卷第源期悦澡蚤灶允耘曾责悦造蚤灶陨灶枣藻糟贼阅蚤泽（耘造藻糟贼则燥灶蚤糟耘凿蚤贼蚤燥灶），晕燥增藻皂遭藻则圆园员园，灾燥造源，晕燥援源·源远苑摇摇·数时病死率及死亡时间仍有很大差异。悦蕴孕模型中被结扎盲肠的长度是影响动物预后的一个重大决定因素，随着盲肠结扎长度的增加，促炎因子也随之增加，其他影响因素包括穿刺数目、穿刺针尺寸等。此外，悦蕴孕模型中肠壁是否完全结扎在一定程度上与动物模型的病死率有很大关联。在悦蕴孕模型上很难对流入腹腔的肠内容物估量，如果出现腹腔感染灶被网膜及周围包裹局限化则无法达到脓毒症动物模型标准，这也是决定疾病严重程度的一个重要因素［猿］。表圆摇悦蕴孕与悦粤杂孕模型特点优点摇摇摇缺点悦蕴孕模型模仿临床阑尾炎穿孔或憩室炎穿孔的特点，脓毒症研究动物模型的“金标准”；在研究细胞功能紊乱、细胞因子分泌模式、性别辕激素的影响、组织动力学和凋亡程序等应用较广泛；可控性高，标准化水平高。多菌群感染存在实验室内差异存在年龄、性别、种族差异自愈性悦粤杂孕模型持续感染形成腹膜炎导致脓毒症，模仿临床上肠瘘的病理变化过程；炎症细胞因子相对悦蕴孕模型检出早，峰值高；变异小，重复性好；至死亡员澡前模型体内生理变化与血液动力学；变化均相对稳定。多菌群感染操作差异特征性血液动力变化少差异未被广泛认识，使用较局限摇摇相比而言，悦粤杂孕模型可以弥补悦蕴孕模型持续性腹腔内感染不足的缺点。悦粤杂孕模型是一种较新且影响因素没有被广泛认识的模型，因此使用相对局限，其特征性血液动力变化不是很显著，影响预后的因素与留置引流管的管径有很大关联。悦粤杂孕模型虽然不涉及悦蕴孕模型中的盲肠结扎问题，但操作难度更大，尤其是升结肠置管后要一直保持引流通畅，否则同样会形成局限性脓肿，影响实验结果。相对悦蕴孕模型而言，变异小、重复性好是悦粤杂孕模型成功至关重要的因素之一，悦粤杂孕模型更适用于脓毒症疾病的研究［猿］。圆援细胞因子及炎症介质的变化：无论是脓毒症模型的设计实验还是药物测试均应考虑到不同脓毒症动物模型所模仿疾病上的差异，临床中弥漫性腹膜炎和局限性腹腔脓肿有着明显不同的预后。因此，不同原因的脓毒症模型不仅在感染发生的病理基础上相异，细胞因子的变化也是千差万别。促炎因子栽晕云在悦蕴孕模型中起保护性作用，而缺失栽晕云受体责缘缘的悦粤杂孕模型与野生型大鼠生存率相近；悦粤杂孕模型中，陨云晕鄄γ受体和陨蕴员圆责源园缺失的大鼠更容易发生脓毒症，但在悦蕴孕模型中这两种大鼠与对照组相比均无明显异常，表明陨云晕鄄γ及陨蕴鄄员圆