中药药理学实验讲义

中药药理学实验讲义成都中医药大学药学院药理2005，121中药药理学实验讲义主编曾南主审沈映君编委曾南王平徐世军谢宇环王张杨旋熊静悦杨莉娟童妍周桢昊李佳川2第一章中药药理实验基本知识一、中药药理实验报告基本要求1.实验前应仔细阅读实验指导，做到心中有数。结合实验内容，复习有理论知识。科研实验还应查阅有关文献资料，吸取他人经验。实验中应认真、仔细、耐心地观察所出现的各种现象，实事求是记录，切忌夹杂主观因素。应坚持一丝不苟，严谨的科学作风，决不允许抄袭别人的实验结果写报告。2.教学实验往往每次是取一种动物,一种方法写实验报告。科研实验则应事先设计好实验动物数，随机分组。新药研制还应设空白与已知药物对照组。科研实验要说明的某一个作用，至少设2～3个以上计量组，要两种以上的实验方法等。3.实验条件应详细、明确，如仪器型号、试剂的浓度、中药的品种、复方的组成、提取方法、浓度和剂量、给药途径、动物的来源、品种、体重、年龄、性别、如何分组等都应写出。4.实验方法可简明扼要地叙述，但关键环节必须写清楚。科研报告还可以引用文献上的方法，以节省文字。5.实验结果应根据实验获得的数据进行整理，对一个教学实验小组或全实验室的数据进行整理、归纳、分析和对比，尽量总结出各种图表，进行统计学处理。6.讨论部分包括实验结果的分析、思考题的探讨、实验设计、实验方法及实验中出现异常现象的分析、认识、体会和建议等。讨论应注意结合中医药理论。科研报告还可对比前人的实验进行分析，阐明从本实验获得的新发现或尚存在问题。7.实验结束应及时地整理和总结实验结果，写出报告。实验报告内容应包括实验名称、目的、原理、材料（包括仪器、药品、动物）、方法、结果、讨论及结论。科研实验报告还应有前言，说明课题来源及本实验要解决的问题；报告后应附有参考文献。二、中药药理实验样品注意事项在进行单味中药或复方中药药理实验时，由于中药不同于西药，多数不是单一化学成分，而是多种成分的综合作用或多种中药的综合作用。因此，在有效成分不3明确的情况下，制备药理实验用的中药样品，应注意多种因素的干扰，影响实验结果。1.药材选择：中药品种、产地、采收季节、炮制加工、霉变虫蛀等多种因素可以影响重要药理作用的实验结果，所以制备中药制剂应首先对中药样品经过鉴定，选择合格中药材进行制备。如果是研究中药新药，受试药物应是处方固定，生产工艺及质量稳定，与临床研究用药剂型相同，并应符合临床用药的质量标准。2.口服制剂：整体动物实验口服或十二指肠给药，对药材加工的中成药制剂，如冲剂、浸膏、丸、丹、片剂等，可用蒸馏水或生理盐水配制成水溶液剂、混悬剂，必要时可加入增溶剂和助悬剂。糖衣片可先剥除包衣再配制。含挥发油的药材应先蒸馏取得挥发油，然后助溶或制成乳剂、混悬剂进行动物实验。若含有麝香、牛黄之类不便提取加工的药材，可直接和水煎液配制成混悬液给药。药效学研究3.离体实验和静脉注射：对于离体实验和注射给药的中药制剂，进行药效学研究时，用不含赋形剂的提取物，应注意药物中的杂质、不溶物质、无机离子及酸碱度对实验的干扰。如制剂中含钙离子进行心脏强心试验，含钾离子进行离体心脏和平滑肌试验，含糅质进行局部止血试验和抗菌试验，含胆碱、腺苷、鞣质、和无机离子静脉注射进行血压试验和血流动力学试验，获得阳性结果应持谨慎态度，常常不能反映药物的真实作用，可能为假阳性结果。因此，最好经过提取和处理。例如为防止阳离子干扰，提取物可通过阳离子树脂处理。必要时可提取有效部位或有效单体进行试验。血管内注射如用乳剂实验，乳剂为油/水型分散相粒子直径不能大于4μm。油性注射剂，混悬剂则不可静脉给药。脑室和脊椎腔（椎管）注射用注射剂必须以纯水为溶媒，不能加入任何助溶剂及抑菌剂。眼用混悬剂药物微粒不能大于50μm。一些药理实验为了除去供试药物中的鞣质、树脂、淀粉及其它杂质，水提取物加入高浓度的乙醇进行沉淀处理，注意这样同时也除去了多糖和蛋白质，如果进行免疫试验时，可能是该被试药物的有效成分。最好是根据中药含有不同的有效成分，采用不同的提取方法和处理方法，制备药理试验样品。4.特殊成分处理：如果要研究某中药的多肽、蛋白质、酶、糖蛋白和其它不稳定成分的药理作用，则需要在低温下制成被试药物或制成冻干剂。临用时加注射用水或生理盐水进行实验。4中药样品制备和配制的具体方法，可参考陈奇主编的«中药药理研究方法学»（人民卫生出版社，1993年）以及其它中药化学、中药药剂学参考书。三、中药药理实验制剂的浓度表示法中药单味和复方制剂，一般以生药量浓度表示法。中药制剂名称在前，浓度在后，通常以g/ml表示液体制剂，以g/g表示固体制剂。如生附子水煎液0.125g/ml表示每毫升制剂中相当于喊生附子量为0.125g,人生总皂甙25mg/片表示每片中含人参总皂甙25mg。四逆汤水煎液3g/ml（附子9g、干姜9g、甘草12g，煎成10ml），表示每毫升制剂含有四逆汤总量的3g。对分子量已经明确的有效单体可用mol/L浓度表示。四、常用实验动物的选择、捉持和给药方法药理实验常用的动物有小白鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猫和犬，某些实验还可以用青蛙、蟾蜍以及鸽、鸡、猴等。由于各种试验的观察目的和内容不同，对动物的选择也有不同。下面介绍几种常用动物的选择、捉拿固定法和给药途径。（一）小白鼠小白鼠是药理实验常用的一种动物，常用于药物的筛选、LD50ED50的测定、中枢神经系统药试验、抗炎免疫药试验、避孕药、抗肿瘤以及抗衰老药试验等。常用体重18～22g。1．捉拿方法右手提起鼠尾，放在粗糙物（如鼠笼）上面，轻向后拉其尾，用左手拇指和食指捏住其头部皮肤及双耳，将小白鼠固定在掌中，使其腹部朝上，然后以第四指和小指夹住鼠尾。2．给药途径：（1）经口给药法：口服（PO）：将受试药物放入饲料或溶于饮用水中，由动物自由提取的一种方法。5缺点是摄入剂量不够准确。灌胃(IG)：将小鼠固定后，右手持装有灌胃针头的注射器，自口角插入口腔，沿上腭插入食道。如遇阻力，可将针头抽出再另插，以免穿破食道或误入气管。灌注量为0.1~0.3ml/10g体重。（2）皮下注射(SC)：常在背部皮下注射。一手固定动物，另一手注射，注射量为0.1~0.3ml/10g体重。（3）肌内注射(IM)：多注射于后肢股部肌肉，每侧不超过0.1ml.（4）腹腔注射（IP）：左手固定小鼠，右手持注射器，从下腹部外侧进针约3~5mm，呈450角刺入腹腔，注射量0.1~0.2ml/10g体重。（5）静脉注射（IV）：将小鼠至于固定筒内，使尾巴露在外面，用70~75%酒精棉球擦尾部，或将鼠尾浸入45~50OC温水中。待尾部左右侧静脉扩张后，左手拉尾，右手进针。注射量不超过0.5ml/只。（二）大白鼠用途与小白鼠相似，常用作抗关节炎药物试验、血压测定、利胆药实验等。常用体重150~200g。1．捉拿方法：基本上同小白鼠。将其放在粗糙物上，右手轻拉其尾，左手中指和拇指放在大鼠左右前肢腋下，食指放入颈部，使大鼠伸开两前肢，便能将其握住。2．给药途径：灌胃、腹腔注射、皮下注射、静脉注射均同小白鼠，给药量为小白鼠的2~3倍。（三）豚鼠豚鼠对组胺很敏感，研究平喘药和抗组胺药时常选用。常用体重300~500g。1.捉拿方法：豚鼠性温和，不咬人。捉拿是以拇指和中指从豚鼠背部伸入腋下，另一手放在臀部，托起即可。2.给药途径：（1）皮下、肌肉及腹腔注射。方法基本同小白鼠，给药量分别为0.5~1ml，0.3~0.5ml、62~4ml。（2）静脉注射：可选用后腿掌外侧的静脉或外颈静脉进行注射。采用前法，可由一人抓持豚鼠并固定一条后腿，另一人剪去注射部位的毛，酒精棉球涂擦使血管扩张。以小儿头皮针头刺入血管推注药物。注射量通常为2~4ml。（四）家兔家兔常用作观察药物对呼吸、心脏、血管、肠肌运动的影响，或用作解热药试验及热源检查。雌兔常用作避孕药研究及观察药物对子宫的影响，以用于长期毒性试验。常用体重为1.5~2.5kg。1.捉拿方法：一手抓住颈背部皮肤，轻轻将兔提起，另一手托其臀部，或将其置于固定箱内。2.给药途径：（1）灌胃：二人合作。一人坐好，将兔夹于两腿之间，左手紧握双耳、固定头部，右手抓住两前肢。另一人将开口器横放于兔口中，压在舌头上面，用一8号导尿管从开口器中央孔插入口内，再慢慢插入食道和胃。为避免误入气管，可将胃管外口端放入清水中，如无气泡出现，即证明在胃内。然后灌入药液，给药量通常为10ml/kg。（2）耳缘静脉注射：用酒精棉球涂擦兔耳或手指弹兔耳，使局部血管扩张。以手指在耳根部压住静脉，然后注入药液。注射量为2ml/kg。（3）皮下、肌肉、腹腔注射方法与鼠类基本相同，最大给药量分别为0.5ml，1.0ml和5.0ml/kg。（五）犬犬常用于慢性实验，如高血压试验治疗、胃瘘、肠瘘，用于观察药物对冠状血流的影响、利尿药实验以及长期毒性实验等。常用体重为5~15kg。1.捉拿方法：一人用长柄钳式捕狗夹夹住犬颈，另一人将犬嘴绑住。绑嘴方法是将绳带从嘴下面绕上来，在鼻子上面打一结，再将绳带绕到最下面打一结，然后将绳带拉到耳后颈部打结固定。72.给药途径：（1）腹腔注射：将犬夹住，用力将头、颈部压在地上。一人提起一侧后肢并将药液注入腹腔。（2）静脉注射：多从后肢外侧小隐静脉或前肢皮下头静脉注射。以手或橡皮管把静脉向心端扎紧，使血管充盈，剪毛，酒精消毒，针向近心端刺入静脉。回抽针栓，如见回血，表示针头在静脉内，即可推注药物。五、中药药理实验研究设计的基本知识实验设计是实验过程的依据，是实验数据处理的前提，也是提高实验研究质量的一个重要保证。严密而合理的实验设计，不但可以对实验结果和误差有比较准确的估计，最大限度地获得丰富而可靠的资料，而且还可以减少人力，节省物理和时间，提高工作效率。因此，实验设计，从实验的研究过程来看，具有非常重要的意义。（一）实验设计的原则和内容1.明确实验研究目的：实验设计，首先应考虑的就是明确实验研究目的。根据实验的中心问题，进行实验内容设计，做到心中有数，有的放矢。2.确定实验组和对照组：实验组和对照组之间除了处理不同，其他条件均应相同，保持实验条件均衡或齐同条件对比的原则。3.确定实验方法、项目和指标：在实验设计中要求观察的指标、项目和方法等都要有明确的规定和说明。要注意选择能反映被研究问题的本质（药物作用及其机理）的关键指标；且能用客观方法，定性或定量地加以测量，取得准确可靠的数据。4.确定实验对象数量：中药药理实验对象包括正常动物、麻醉动物及病理模型；既有整体动物，又有离体器官、组织和细胞等。尽量研究各种接近中医临床的动物病理模型；按中医治疗原则，观察中药疗效。动物模型必须具备主要症状、体征，经化验和病理组织学等证实。但也不排除对正常动物或离体器官等的作用分析。由于动物实验和临床观察毕竟有差别，因此考虑用不同动物多种模型，往往也是必要的。要根据实验目的、方法和指标的要求决定实验动物、样本及数量。在教学实验中则可以将全实验各组结果合并统计处理，以保证样本数量上的要求。一般小动8物（大、小鼠）每组8～12只，较大动物（兔、狗）每组5～8只，但总量应符合统计要求。5.资料整理：将记录的资料进行必要的整理、分析，经过正确的统计处理，作出结论。（二）实验设计的基本要求实验设计的三大原则就是随机、重复和对照。1.随机：就是使每一个体在实验中都有同等机会均衡地分配到各组或处理。以减少主观因素的影响或避免影响或避免偏性误差，使样本的生物差异均衡地分配到各组中去。随机话的手段可采用编号抽签法，随机数字表和计算器的随机数字键。近年提出“均衡下的随机”，即将可控制的因素（如体重、性别等）先均衡地归类分档，然后在每一档中随机地取出等量动物分到各组，使难控制的因素（如活波、饥饱、疲劳程度及性周期等）得到随机化的分配。2.重复：能在同样条件下，把实验结果重复出来，才算是可靠的实验。重复除可增加可靠性外，也可知道实验变异情况。重复次数多少要根据实验要求和性质，主要药效指标稳定的实验，一般重复2～3次。3.对照：比较研究是科学实验不可少的条件，任何实验都要求都不能缺少对