酵母双杂实验操作手册和注意事项

1酵母双杂（Yeasttwo-hybrid）实验操作手册和注意事项一.酵母双杂的原理1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-bindingdomain，BD）与转录激活域（Transcriptionalactivationdomain，AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株则具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。二.所用的载体及相关信息1.pGBKT7载体的图谱和相关信息ThepGBKT7vectorexpressesproteinsfusedtoaminoacids1–147oftheGAL4DNAbindingdomain(DNA-BD).Inyeast,fusionproteinsareexpressedathighlevelsfromtheconstitutiveADH1promoter(PADH1);transcriptionisterminatedbytheT7andADH1transcriptionterminationsignals(TT7&ADH1).pGBKT7alsocontainstheT7promoter,ac-Mycepitopetag,andaMCS.pGBKT7replicatesautonomouslyinbothE.coliandS.cerevisiaefromthepUCand2mori,respectively.ThevectorcarriestheKanrforselectioninE.coliandtheTRP1nutritionalmarkerforselectioninyeast.YeaststrainscontainingpGBKT7exhibitahighertransformationefficiencythanstrainscarryingotherDNA-BDdomainvectors(1).b.pGADT7载体的图谱和相关信息2pGADT7-TencodesafusionoftheSV40largeT-antigen(a.a.86–708)andtheGAL4AD(a.a.768–881).TheSV40largeTDNA(GenBankLocusSV4CG)wasderivedfromaplasmidreferencedinLi&Fields(1993)andwasclonedintopGADT7usingtheEcoRIandXhoIsites.pGADT7-Thasnotbeensequenced.三．实验主要流程A.需要准备的药品和设备1.两种酵母菌种(AH109,Y187)2.酵母培养所需的药品:YeastnitrogenbasewithoutaminoacidsAgar(forplatesonly)sterile10×DropoutSolution单缺-T,-L(clontech公司)二缺-T/-L(clontech公司)四缺-T/-L/-Ade/-His(clontech公司)3.酵母转化所需的药品:10×TEbuffer10×LiAc40%PEGcarrierDNA4.酵母显色所需要的药品:x--GAL5.其他仪器设备:30℃恒温培养箱30℃摇床.水浴锅分光光度计B．DNA-BD和DN-ADfusionprotein载体的分别构建。1．纯化基因片段。2．用相应的酶对DNA-BD载体进行酶切和纯化。3．连接酶切片段和载体，转化到E.coli。4．通过内切酶分析或PCR对载体进行分析鉴定。以上步骤基本同一般载体的构建。C.BD自激活作用的检测。1.把载体转化到AH109和Y187中。把转化产物在三种培养基中生长,用空的DNA-BD载体作阴性对照。SD/-Trp/x-ａ-Gal、3SD/-His/-Trp/x-ａ-Gal、SD/-Ade/-Trp/x-ａ-Gal。2.分析结果如果转化克隆是蓝色，在SD/-His/-Trp、SD/-Ade/-Trp上可以生长，说明其自身激活报告基因转录，则不能用做诱饵蛋白。D.融合蛋白毒性的测试比较带有DNA-BD融合蛋白载体和空的DNA-BD载体的Y187和AH109的转化子菌系在液体培养中的生长效率。如果bait菌系生长速率要明显慢很多，则此bait蛋白可能有毒性。在SD/-Trp上筛选，如下准备过夜培养:挑一个较大的克隆（2-3mm）在50mlSD/-Trp/Kan（20ug/ml）培养液中生长。30°，250-270rpm培养16-24h。检查培养液的OD600值，它应当〉0.8。若小于，则DNA-BDfusion可能有毒性。如果没有妨碍生长，则是非毒性的，可以用来做双杂交筛选。E.酵母的小规模转化方法1.在1ml的YPD培养基中，接种酵母AH109(或Y187)。2.震荡，打散细胞。3.将细胞转移到20mlYPD中，锥形瓶的规格为250ml比较合适，较多地空气有利于酵母生长。30℃振荡培养12小时，OD6001.6/不大于2.0即可。4.取合适的菌液至100mlYPD中，使OD600在0.2-0.3之间。250rpm振荡培养3小时，直到OD600在0.4-0.6之间。5.菌液移入50ml离心管中，室温下1000g,离心5分钟。6.去上清，用25ml无菌水重悬细胞。7.室温下1000g,离心5分钟。再去上清液，用1.5ml1×TE/1×LiAc轻轻重悬细胞，制成感受态酵母菌。8.分装感受态细胞，100μl为一管。在每管中加入0.1μg的carrierDNA和0.1μg目的质粒。轻轻混合均匀。9.加入0.6mlPEG/LiAc，高速振荡10秒钟。10.30℃,250rpm摇床,摇30分钟。11.每管加入70μl的DMSO,轻轻的混匀,不要剧烈震荡。12.在42℃水浴锅中,热激15分钟。13.在冰上冷却1—2分钟。14.在室温下.14000rpm高速离心5秒,去上清液。15.用0.5ml的1×TEbuffer悬浮细胞。16.以适量的菌液涂平板,在30℃下,培养2-4天。F.转化效率的计算数出稀释平板上的克隆数目：克隆数*1000=#转化数/3ug载体。预期结果：〉1×106转化数/3ug载体。G.酵母质粒的抽提1．细胞沉淀在250µl抽提液中悬浮2．加入20µl0.45-0.55mm玻璃珠，重复悬浮震荡。3．加入250µl酚：氯仿，混匀。4．15000g，离心3min。5．取上清，加入3倍体积无水乙醇，混匀。46．15000g，离心5min。用70%乙醇洗涤沉淀。7．20µl无菌水溶解。质粒抽提液：10mMTris-Hcl，1mMEDTA，200MmNaCl，PH8.0四.几个重要的问题的说明和一些实验中的心得体会注意问题一:载体的构建需要考虑到移码问题。在酵母双杂中，所用到的蛋白都是融合蛋白，基因本身的起始密码子ATG是不起作用的,所以特别要考虑到移码问题。无论是AD-基因，还是BD-基因，都是如此。在融合蛋白之间可以有一段连接序列，但必须是三的倍数，确保目的基因在表达时不会移码。注意问题二：酵母感受态制备的心得。酵母感受态的制备是个很重要和精细的过程。感受态的状态不佳，极大地影响到酵转化的效率。这里有两点要注意。a.原始菌种接种的量。在1mlYPD培养基中，接种AH109的克隆时，大于2-3mm的大克隆，接种一个；大小在2-3mm之间的克隆，接种2-3个；小于2mm的克隆，不能用于正常的接种，重新划板活化之后再行接种。b.酵母转接时的OD值掌握。对数生长期的酵母菌转接到100ml的YPD中，经验量:1.6OD600的原菌液，取4ml左右。2.0OD600的原菌液，取4ml左右。OD600大于2.0，原菌液就不能使用了，影响活性。注意问题三：PEG浓度的改良。一般经典的酵母操作手册上，在酵母转化时，用到的PEG的浓度都是40%。经过我的多次试验，40%的PEG所得到的转化效率不是最高的，35%的浓度为最好。其配方改良如下：PEG50%8ml改良为PEG50%7ml10×LiAC1ml-----------------------------10×LiAC1.5ml10×TE1ml10×TE1.5ml降低5%PEG浓度可以提高转化效率。注意问题四：转化所用的质粒的量。在酵母转化的时候，所用质粒的浓度和纯度都是很重要的指标。经验浓度为200ng/μl以上，纯度则是尽可能的高。质粒的总量需要在1μg以上。注意问题五：AH109,Y187酵母菌种的保存和使用问题。酵母的菌种长期不用的保存在-80℃冰箱中。但经常要使用的菌种保存在4℃冰箱的平板上最好。把克隆长到3mm大小的酵母菌种平板保存在4℃冰箱里，要用时就可以随时挑克隆了。但平板的保存时限为一个月，每个月需要重新划线转移一次平板，以保证其活性。直到酵母相关实验全部完成为止。注意问题六：酵母菌落的颜色问题。正常的酵母菌落颜色是纯白色的，但经过转化的酵母常常带有一定的微红色。Y187的菌种基本不会变红，颜色是正常的。而AH109的菌种中Ade基因容易突变，从而导致酵母颜色的改变。但微红色的酵母基本上不影响下一步的操作。AH109经过酵母单转化之后，在平板上会有微红色，但共转化之后就没有红色了。注意问题七：酵母双杂Mating的时间掌握。一般认酵母双杂Mating的时间为16-24个小时。我经过试验，Mating的时间上限为285个小时，下限为14个小时。以18个小时为最佳，低于14个小时的Mating是一定失败的。酵母Mating的时间，是一个重要的试验参数。注意问题八：pCL1，pGBKT7-T和pGBKT7-53的阳性对照的问题。pCL1载体不能用做互作对照，互作对照使用BKT7-T和pGBKT7-53。同时转入后个载体的酵母可以在相应的营养缺陷型培养基上生长。注意问题九：酵母的显色问题。蛋白互作到一定程度的酵母菌，可以在涂有x-α-Gal的平板上显色。这里所用的显色剂是x-α-Gal。而我们平时在大肠杆菌的蓝白斑筛选的时候所用的是x-β-Gal。两者的价格和作用相差很大，不能混用。注意问题十：酵母的划线问题。最后得到的结果，是要在平板划线拍照的。划线的质量好坏，严重的影响了结果的美观，同时也使结果的可靠性受到质疑。划线使用的酵母菌液需要测量OD值，OD600值在0.5时划线最合适。低于0.5的菌液往往造成划线的不连续，太高的菌液会使克隆长成一团，看不到清晰的酵母菌落。