琼脂糖凝胶电泳试验课件

琼脂糖凝胶电泳技术实验三一、实验目的学习与掌握DNA电泳的技术方法，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度、含量以及分子量，及分离不同大小DNA片段。二、材料、试剂和仪器材料：质粒、银杏DNA试剂：DL2000Marker、琼脂糖、50×TAEelectrophoresisbuffer、6×loadingbuffer、EB贮存液、双蒸水仪器：电泳仪、微波炉、成像系统、电子天平、移液器、一次性薄膜手套、量筒、烧杯、三角瓶、吸头等三、实验原理概言之：DNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子筛效应向正极移动过程中，因DNA分子的大小及构象差别而呈现迁移位置上的差异，对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比，电泳时加溴化乙锭，其与DNA结合形成一种荧光络合物，在254~365nm紫外照射下可产生桔红色的荧光，可用于检测DNA。（此法可观察到凝胶中2ng左右的DNA）。琼脂糖可制成不同孔径的凝胶，分离DNA的范围广，约200bp~50kb。琼脂糖是一种线性多糖聚合物，当其加热到沸点后再冷却凝固就形成良好的电泳介质，其孔径决定于其浓度。电泳介质中的孔径对电泳迁移中的带电分子产生一种阻力，阻力的大小取决于带电分子的大小及其物理性状。在生理条件下，核苷酸的磷酸基团是带负电荷的，所以DNA分子是多聚阴离子，在电场中向正极迁移。DNA分子带电量与其大小成正比的。在一定电场强度下，若无任何介质阻碍迁移，则大DNA分子比小DNA分子跑得快。但在实际电泳中，由于使用了琼脂糖分子筛介质，对大分子DNA产生了较强的阻力，因此大分子DNA尽管有较高的带电量，仍难以快速前进；小分子DNA由于能够穿越介质网孔，其带电量尽管相对较小，但仍能快速迁移到正极。因此，不同的DNA分子在琼脂糖凝胶中产生了不同的迁移距离，这种迁移距离的差异使得不同大小DNA得以分离。核酸迁移率的影响因素：影响核酸电泳的因素1）核酸的性质核酸的电荷量、分子大小、分子空间构象决定了不同核酸分子具有不同的迁移率。线性双链DNA分子，分子量的常用对数与泳动率呈反比关系；而分子的空间构象影响影响泳动速率，如分子量相同的质粒DNA的迁移速率则是：闭环型线性单链开环型。其他结构如：(A)单链RNA或单链DNA的分子内局部配对；(B)与蛋白质结合的DNA复合体2）凝胶孔径大小琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamidegel，PAG）是核酸凝胶电泳常使用的支持材料，通过两种支持介质的浓度变化调整所形成凝胶的分子筛网孔大小，能分离不同分子量的核酸片段。凝胶胶浓度（%）线状DNA分子的有效分离范围琼脂糖0.35~60(kb)0.70.8~100.90.5~71.20.4~61.50.2~42.00.1~3PAG3.5100~2000(bp)5.080~5008.060~40012.040~20015.025~15020.06~100不同（空间）类型核酸的凝胶电泳：单链RNA或单链DNA——变性胶电泳：在缓冲液和凝胶中加入尿素或甲醛等核酸变性剂，使分子内配对结构打开，使其带电量和分子形状无关，仅与分子大小有关。质粒（具有高级结构的DNA）——一般的琼脂凝胶电泳；但由于结构的不同可能会出现不同的条带。比较大的DNA分子——脉冲式电泳与蛋白质结合的DNA复合体——凝胶电泳阻滞分析（electro-mobilityshiftassay,EMSA）。3）电场强度和电场方向低电压时，线状DNA片段的电泳迁移率与所加的电压成正比，通常凝胶电泳的电场强度不超过5V/cm凝胶。对于大分子量真核基因组DNA片段的电泳常采用0.5~1.0V/cm电泳过夜，以取得较好的分辨力和整齐的带型。可以通过脉冲电场凝胶电泳分离极大片段的DNA。4）电泳环境缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。传统最常用的是TAE，但其缓冲能力很低，长时间电泳需要正、负电极贮液槽之间进行缓冲液循环，并经常更新TAE。缓冲液的离子强度与样品泳动速度成反比，电泳的最适离子强度一般在0.02~0.2之间。在高速离子强度下（如误加10×电泳缓冲液），溶液导电性极高并明显产热，可能引起凝胶熔解及DNA变性。缓冲液的pH值影响DNA迁移率，溶液的pH值远离样品等电点时，样品荷电量越多，泳动越快，核酸电泳液常用偏碱性或中性条件，使核酸带负电荷，向正极泳动。在进行电泳时，荧光染料EB可插入到碱基中，从而增加线状和开环DNA的长度，使其刚性更强，并会使线状DNA的迁移率降15%，另外温度和碱基堆积也会影响DNA的迁移率。1.利用EppendorfBiophotometer测定基因组DNA、质粒pGEX-4-T的浓度和纯度。1）将所给DNA样品用无菌蒸馏水分别稀释2倍和10倍，并编号：DNA1、DNA2，pG1、pG2；2）用无菌蒸馏水清洗干净的比色杯倒置在吸水纸上晾干，用移液枪吸取1ML左右的无菌水于一个比色杯中作为空白对照；3）以无菌蒸馏水作空白调试核酸浓度测试仪，分别测定各稀释样品的浓度和纯度，并记录所得数据；每个样品测3次重复。4）按稀释倍数计算出原DNA样品浓度。1）取50×TAE缓冲液母液适量（多少？）加蒸馏水配成1×TAE电泳缓冲液；2）称量琼脂糖（多少克？），转入三角瓶内，加TAE缓冲液用微波炉熔化；3）装好凝胶板并插入梳子，放在水平台上，注意梳子底端应距凝胶板面有0.5~1mm的间隔；4）待胶冷却到60~70℃加入EB至终浓度为0.5μg/ml，待胶冷却到50~60℃（手能触摸的温度）倒入封好的凝胶槽，厚度约3~5mm，注意检查是否有气泡产生，如有可用吸管小心吸出气泡。四、实验过程5）凝胶冷却凝固后小心取出梳子及挡板，放入水平电泳槽中，缓冲液淹没过胶1~2mm。6）点样：样品中加入1/5体积的上样缓冲液（6×loadingbuffer），混匀，取10~15μl加入凝胶点样孔中，同时上5~6μlDL2000Marker作为DNA分子量标准物以估测DNA样品大小。7）电泳：接好电泳仪导线，注意正负极的位置；恒压电泳。电压＜10V/cm，电泳至溴酚兰移出点样孔到凝胶板2/3距离时，关闭电源。8）取出凝胶块，置紫外透射仪或成像系统上观察，即可见橘红色或白色DNA条带。实验过程简图Note:熔解凝胶或打开沸腾盖子，易挥发掉水蒸气，从而改变琼脂糖浓度，因此沸腾后的凝胶不宜马上开盖，而应等温度下降到手可接触的温度时才开盖。Note:凝胶充分凝固前拔梳子可能导致穿孔；在保湿状态下，4℃下可存放凝胶1~2周，常温下可存放数日电泳电极和电泳槽及胶孔的位置样品加入上样缓冲液电泳完毕后上样缓冲液状态作业1.将实验内容和结果填写在实验报告本上。2.琼脂糖电泳原理是什么？3.在琼脂糖凝胶电泳过程中有哪些因素会影响电泳结果？谢谢！请大家开始分组实验