4-核酸分子杂交技术2011

核酸分子杂交（DNA/DNAorDNA/RNA）核酸分子杂交技术：具一定同源性的两条(DNA或RNA)单链在适宜的温度及离子强度等条件下,可按碱基互补配对原则特异性地复性，形成双链探针(序列已知，单链)待测核苷酸序列(单链)主要内容第一节分子杂交技术的理论基础第二节核酸分子杂交的方法第三节核酸杂交的探针核酸分子杂交技术：1968年华盛顿卡内基学院（CarnegieInstituteofWashington）的RoyBritten及其同事发明的第一节分子杂交技术的理论基础变性复性DNA-DNA杂交双链分子关键步骤：变性—杂交（复性）--检测信号—结论信号的采集与处理结论一、DNA变性与复性（一）DNA变性1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性2、变性的方法：1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸分子链间的氢键完全断裂。2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链间的氢键断裂。3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢键断裂3、核酸溶液变性后的理化性质变化：粘度降低密度增加紫外吸收值增加(利用DNA变性后波长260nm处紫外吸收的变化追踪变性过程)4、DNA变性曲线AT区先解链，GC区后解链，阶梯式曲线，当达到一定温度时，DNA双螺旋几乎是同时解开的变性DNA/总DNATm值：50%DNA分子发生变性的温度（即熔解曲线中点对应的温度），这一现象和结晶的融解相类似，故又称融点或融解温度（meltingtemperature,Tm）Tm是指消光值上升到最大消光值一半时的温度5、GC含量与Tm值(meltingtemperature)之间的关系（G+C）%=（Tm-69.3)×2.44Tm=(G+C)%×0.41+69.3Tm不是一个固定的数值，它与很多因素有关：pH值、离子强度和DNA的碱基比例DNA制剂不应保存在离子强度过低的溶液中，一般保存在1mol/lNaCl溶液中较稳定（二）复性1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。2、复性过程1）单链分子间碰撞形成局部双链2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列3）形成完整的双链分子3、复性的速率方程（服从二级反应动力学）dCdt=K2C2（1）将（1）积分CCo11+K2Cot=（2）一半单链DNA分子复性时，（2）式中的为121211+K2Cot=Cot1/2值越大，复性速度越慢CCo（3）1K2Cot1/2=二、影响杂交的因素1、核酸分子的浓度和长度：浓度越大，复性速度越快分子越大，复性速度越慢单链探针，浓度增加，杂交效率增加双链探针，浓度控制在0.1-0.5μg,浓度过高影响杂交效率2、温度：（1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20-25℃（2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低Tm值（原位杂交时，杂交液中加入适量的甲酰胺，可避免因杂交温度过高而引起的组织形态结构的破坏以及标本的脱落）（3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃3、离子强度：（1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加（2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定（当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度）4、甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定（1）当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在35~42℃杂交（2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在68℃杂交5、核酸分子的复杂性：（1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度，Cot½与反应体系中核酸复杂性成正比（Cot1/2值越大，复性速度越慢）（2）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性6、非特异性杂交反应：（1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附（2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉膜上印迹杂交原位杂交RNA酶保护分析法核酸酶S1保护分析法第二节核酸分子杂交的方法按待测核酸是否固定在固相支持物上分：•固-液相杂交•液相杂交核酸分子杂交实验步骤：印迹转移：将核酸样品转移到固相支持物滤膜上主要三种方式：毛细管虹吸作用真空抽滤作用电场作用杂交：将具有核酸等样品印迹的滤膜同带有放射性标记或其他标记的DNA或RNA探针杂交2、常用的印迹转移方法（Southernblot）1）毛细管虹吸印迹法利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移到固相支持物上2）电转法利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上3、同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上1、转移缓冲液中含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠2、上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动3）真空转移法原理与毛细管虹吸法相同不同点：滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上SouthernDNA印迹杂交EdwinMellorSouthernSouthernDNA印迹杂交使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段。E.Southern于1975年首先设计出来的，故又称：SouthernblotSouthern印迹杂交的主要流程1）待测核酸样品的制备1、裂解或破碎细胞2、抽取纯化基因组DNA3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段2）待测DNA样品的电泳分离1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶分离小片段用高浓度胶2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子DNA泳动慢,小分子DNA泳动快，大小相同的分子处于同一条带3、分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂交所用分子量标准可用核素标记3）凝胶中核酸的变性（碱变化）凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性为较短的单链DNA,然后置于中性缓冲液或者凝胶缓冲液之中4）Southern印迹指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程理想的固相支持物应具备的特性①具有较强结合核酸分子的能力②不影响与探针的杂交反应③与核酸分子结合稳定牢固④具有良好的机械性能非特异吸附少常用的固相支持物(滤膜)尼龙滤膜硝酸纤维素滤膜叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM）二乙氨乙基纤维素滤膜（DEAE）特点：进行核酸杂交时，滤膜容易操作和保存（与凝胶相比）滤膜的选择核酸的特殊性、分子大小杂交过程中所涉及的步骤的多寡及敏感性等参数硝酸纤维素滤膜：不能滞留小于150bp的DNA片段不能同RNA结合广泛变性后的RNA很容易转移到硝酸纤维素滤膜（P.S.Thomas,1983）改变缓冲液可以改善硝酸纤维素滤膜对小片段DNA的滞留能力(G.E.Smith,1980:1mmol/LCH3COONH4和0.2mmol/LNaOH缓冲液代替SSC)尼龙滤膜较为理想的固相支持物结合核酸能力强转膜后可多次重复使用（每次杂交的探针可以洗去而结合的DNA酶切片段不容易被洗去）缺点：杂交信号的本底较高5）Southern杂交1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点预杂交液为不含DNA探针的杂交液2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的DNA6）杂交信号检测1、放射自显影：适用于放射性核素标记的探针2、比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针SouthernDNA印迹杂交之X光显像图片水稻（OryzasativaL.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加样在含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带，表明含有水稻的psbA基因序列利用非放射性探针检测核苷酸生物素（biotin）--抗生物素蛋白（avidin）抗生物素蛋白（a）（b）（c）（d）（e）基因组DNADNA限制片段硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因DNA片段X光底片Southernblot操作流程7）Southern杂交的应用1、酶切图谱分析2、特定基因定性和定量3、基因突变分析4、限制性片段长度多态性的分析Northernblot1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法因此法与Southernblot杂交技术十分类似，故叫做NorthernblottingNorthern印迹杂交1、基本原理和基本过程与Southernblot基本相同2、鉴别RNA3、探针可用DNA或RNA片段4、待测样品为总RNA或mRNANorthern印迹与Southern印迹的不同点1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，避免单链RNA自身形成高级结构和自身降解[变性凝胶电泳(甲醛、尿素、甲酰胺等)+RNase抑制环境]，DNA电泳前和电泳中不变性2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理3、靶核酸为RNAWestern印迹杂交检测的蛋白质经PAGE凝胶电泳并染色后，转移到滤膜上固定，然后用“抗原-抗体”免疫反应或“DNA-Protein”结合反应来鉴别滤膜上的蛋白质用来分析样品中蛋白质的种类及分子质量Western印迹法步骤先将蛋白通过SDS-PAGE电泳分离开来，再利用电场力的作用将胶上的蛋白转移到固相载体（NC膜）上，然后加抗体形成抗原抗体复合物，利用发光或显色原理将结果显示到膜或底片上斑点印迹杂交（dotblotting）狭线印迹杂交（slotblotting）更适于核酸样品的定量检测原理与Southern杂交相同在实验过程中，使用特殊设计的加样装置，使众多的待检测样品能够一次同步转移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线阵斑点及狭缝印迹杂交的特点1、斑点印迹为圆形2、狭缝印迹为线状3、鉴别DNA、RNA4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量原位杂交（insituhybridization）生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑是按照原来的位置不变地转移到滤膜上，并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用1975年Grunstein和Hongess发展起来的原位杂交不需从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，在临床应用上有独特的意义原位杂交定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA杂交•保持组织细胞的形态•对核酸无抽提，修饰与降解作用•不改变核酸在组织细胞内的定位•不阻碍核酸与探针的杂交过程•对杂交信号无遮蔽作用•理化性质稳定2、杂交过程：（1）组织或细胞的固定理想固定液应具备：（2）组织细胞杂交前的预处理•去垢剂（如Tritonx-100和SDS）和蛋白酶K去除核酸表面的蛋白质•组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体•控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻片上脱落（3）探针的选择与标记•以获得最好杂交效果为依据选择探针•探针的长度一般为50~300bp,有时达1.5kb•放射性核素标记探针敏感性高，操作