第13章-水卫生生物学

第十三章水卫生生物学一、水中的病原微生物及其危害13.1水中的病原微生物水中的微生物包括致病性微生物和非致病性微生物。水中的病原微生物一般是从外界环境污染而来的，特别是人和其他温血动物的粪便污染。细菌病毒原生动物致病性微生物与水有关的疾病饮水传播性疾病：通过摄入被污染的水而被传染和传播的疾病。流行性霍乱、伤寒洗水性疾病：与恶劣卫生条件和不适当的环境卫生相关的疾病。结膜炎、砂眼、腹泻与水有关的疾病水依赖性疾病：由生活在水中或依赖水生存的病原体引起的疾病。血吸虫病、军团病水相关性疾病：通过在水中繁殖或靠近水边生活的某些昆虫传播的疾病。黄热病、登革热、丝虫病、疟疾、昏睡病致病性大肠杆菌二、水中的病原细菌腹泻血性腹泻伤寒杆菌（沙门氏菌）发烧脾脏肿大红斑腹泻痢疾杆菌（志贺氏菌）发病急腹痛腹泻呈现全身中毒症状感染剂量小霍乱弧菌呕吐腹泻失水死亡率甚高军团菌咳嗽胸痛血痰呼吸困难休克粪链球菌（粪肠球菌）尿路感染化脓性腹部感染败血症心内膜炎腹泻发烧三、水中病毒肠道病毒（脊髓灰质炎病毒）（柯萨奇病毒）（埃可病毒）肝炎病毒轮状病毒SARS冠状病毒MERS冠状病毒四、水中的病原性原生动物隐孢子虫与贾第鞭毛虫（两虫）“两虫”属水媒性寄生原生动物中最容易通过饮用水传播给人、动物和禽畜的。“两虫”其孢囊和卵囊在人和动物粪便中数量大，在外界环境中抵抗力强，感染途径和方式简单，流行分布广泛。症状：严重腹泻、恶心、呕吐或低度发烧特点：发病率高（40%），治疗效果差。1993年4月美国密尔沃基地区爆发涉及40万人的隐孢子虫病；1996年6月日本琦玉县发生隐虫污染自来水，8800人受感染；1998年7月澳大利亚悉尼发生“两虫”污染供水事故，劝告市民饮用煮沸的自来水。五、水中的寄生虫蛔虫、血吸虫等粪便施肥：曝晒、堆肥城市污水：不能直接用于灌溉饮用水：必须过滤、消毒13.2水质生物学指标水的生物学指标主要是用来评价水中的病原微生物，预防流行性传染病的大范围爆发。在当前技术水平下，如果要对水中每一种可能的病原微生物都进行监测不切实际。评价水中的病原微生物的合理办法是：检测人和其他温血动物的粪便中通常存在的非致病微生物，作为指示微生物。一、水质生物学指标概述一般来说，指示微生物除了本身不能是致病微生物外，还应具备以下特征：这类微生物仅存在于粪便等污染源中，且数量较多；与病原微生物的生理特性相似；在洁净水体中不存在、与病原微生物相当在外界的存活能力相似；在宿主外不繁殖；容易检测。二、病原细菌的指示微生物（一）菌落总数（standardplate-countbacteria）水样在营养琼脂上有氧条件下37℃培养48h后，所得1ml水样所含菌落的总数。注意：上述定义与课本上定义不同。课本上指标名为“细菌总数”，培养时间为24h。该检测作为指示致病菌存在的指标意义不大，不能说明污染来源，必须结合其他指标如总大肠菌群、耐热大肠菌群来判断水质污染的来源。指示意义该指标可以作为判断被检水样污染程度的标志。评价水质清洁程度和考核水处理或消毒效果的指标。菌落总数增多说明水被有机物污染程度大。还可用于评价输配水系统清洁度、完整性以及是否存在生物膜。在输配水系统中，菌落总数的增加意味着水清洁度恶化、水流可能停滞和有生物膜形成。（二）总大肠菌群总大肠菌群又称大肠菌群，是指一群在37℃培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。1、为什么以大肠菌群作为指示微生物呢？肠道正常细菌有3类：大肠菌群、肠球菌、产气荚膜杆菌大肠菌群的生理习性与伤寒杆菌、副伤寒杆菌和痢疾杆菌等病原菌的生理特性较为相似，在外界生存条件也与上述病原菌基本一致；另外大肠菌群在人的粪便中数量很大，检验技术并不复杂。而肠球菌抵抗力弱，生存时间比病原菌短，水中若未检出肠球菌，并不能说明未受粪便污染。产气荚膜杆菌因为有芽孢，能在自然环境中长期生存，它的存在不能说明水是近期受粪便污染的。2、大肠菌群的主要特征一群在37℃培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。主要包括大肠埃希氏杆菌、柠檬酸杆菌和副大肠杆菌等。分解葡萄糖、甘露醇及乳糖的能力有差别在远藤氏培养基上所形成的菌落不同在EMB培养基上所形成的菌落不同生活饮用水卫生标准GB5749－2006表1水质微生物常规指标及限值指标限值总大肠菌群（MPN/100mL或CFU/100mL）不得检出耐热大肠菌群（MPN/100mL或CFU/100mL）不得检出大肠埃希氏菌（MPN/100mL或CFU/100mL）不得检出菌落总数（CFU/mL）100※在常规项目中，2006标准增加了大肠埃希氏菌、耐热大肠菌群；修订了总大肠菌群思考：为什么会增加这两项指标呢？世界卫生组织——2005年《饮用水水质准则》第三版（第一次增补本）中则指出：总大肠菌群包括能够在水中存活和生长的微生物，因此，它们不能作为粪便致病菌的指标。大肠菌群总数不适宜作为供水卫生质量的指标，特别是在热带地区，几乎所有未经处理的供水中均存在大量无卫生学意义的细菌。（三）耐热大肠菌群（粪大肠菌群）耐热大肠菌群：耐热大肠菌群是总大肠菌群的一部分，用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开，在44.5℃仍能生长的大肠菌群，称为耐热大肠菌群。它们由埃希氏菌属以及克雷伯菌属、肠杆菌属和柠檬酸杆菌属中的一些菌种组成。耐热大肠杆菌中的主要优势菌为大肠埃希氏菌。（四）大肠埃希氏菌大肠埃希菌是粪便污染最有意义的指示菌，已被世界上许多组织、国家和地区使用。若水样检出大肠埃希菌说明水质可能受到严重污染。耐热大肠菌群比总大肠菌群能更确切地反映饮用水受人和动物粪便的近期污染及污染的程度，也较为实用和可行。关于耐热大肠菌群与大肠埃希氏菌的检验当水样检出总大肠菌群时，应进一步检验大肠埃希氏菌或耐热大肠菌群；水样未检出总大肠菌群，不必检验大肠埃希氏菌或耐热大肠菌群。三、病毒的指示微生物目前仅有美国、加拿大等极少数国家在饮用水标准中明确规定了对病毒的处理要求。我国最新的《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)并未将其列入。WHO的《饮用水水质准则》2008年的增补本中关于病毒类列举了腺病毒、肠道病毒等8种，然而许多指标并未做出明确的限值规定。WHO针对病毒提出绩效目标的概念，即测定微生物数量减少程度以确保水的安全性。目前以噬菌体作为人体病毒的指示物。SC噬菌体可以反映水受粪便污染的程度F-噬菌体在性质和对消毒的抗性上最接近肠道病毒，适宜作为肠道病毒的指示物。脆弱拟杆菌噬菌体仅在人类粪便中被分离出来，在其他动物粪便中未被分离出来，因此可专门作为人类粪便污染的指标。四、病原性原生动物指标目前采用的US-EPA1623方法是标准化的方法，可同时检测“两虫”。该方法的主要步骤为过滤、洗脱、浓缩、分离纯化、荧光显色和镜检。美国EPA研究表明，降低出厂水浑浊度至0.5NTU可大大降低原虫的传播危险，浊度低于0.3NTU，原虫去除率达99%，浊度0.1NTU，去除率达99.9%。生活饮用水卫生标准GB5749－2006表2水质微生物非常规指标及限值指标限值贾第鞭毛虫（个/10L）＜1隐孢子虫（个/10L）＜1“水质非常规指标及限值”所规定指标的实施项目和日期由省级人民政府根据当地实际情况确定，并报卫生部、建设部和国家标准委备案，自2008年起三个部门对各省非常规指标实施情况进行通报，全部指标最迟于2012年7月1日实施。一、菌落总数的测定13.3水的卫生学检验方法水样在营养琼脂上有氧条件下37℃培养48h后，所得1ml水样所含菌落的总数。测定生活饮用水的方法无菌操作将1ml水样注入灭菌平皿，以45℃营养琼脂培养基倒平板，并立即旋摇混均。37℃倒置培养48h后，计菌落总数二、大肠菌群数测定（一）发酵法（1）初发酵试验本试验是将水样置于糖类液体培养基中，在一定温度下，经一定时间培养后，观察有无酸和气体产生，即有无发酵，而初步确定有无大肠菌群存在。取10mL水样接种到10mL双料乳糖蛋白胨培养液中，取1mL水样接种到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，另取lmL水样注入到9mL灭菌生理盐水中，混匀后吸取lmL（即0.1mL水样）注入到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度接种5管。产酸产气情况：如无气体和酸产生，则为阴性反应，即可报告为总大肠菌群阴性。如有气体和酸产生，或虽无气体但有酸产生，则初定为阳性反应，需作进一步检验。对已处理过的出厂自来水，需经常检验或每天检验一次的，可直接种5份10mL水样双料培养基，每份接种10mL水样。将接种管置36℃±1℃培养箱内，培养24h±2h如有气体产生，但没有酸，溶液也不浑浊，则操作技术上有问题，须重作检验。（2）平板分离这一阶段的检验主要是根据大肠菌群在固体培养基上可以在空气中生长，在鉴别培养基上有典型菌落，革兰氏染色呈阴性和不生芽孢的特性来进行的。将产酸产气的发酵管分别转移在伊红美蓝琼脂平板上，于37℃±1℃培养箱内培养18h～24h，观察菌落形态，挑取符合下列特征的菌落作革兰氏染色、镜检和证实试验。深紫黑色、具有金属光泽的菌落；紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色、中心较深的菌落。（3）复发酵试验本试验是将可疑的菌落再移植于糖类培养基中，观察其是否发酵，是否产酸产气而最后肯定有无大肠菌群存在。经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽饱杆菌，同时接种乳糖蛋白胨培养液．置36℃±1℃培养箱中培养24h±2h．有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在。革兰氏染色、镜检结果革兰氏阴性菌革兰氏阳性菌阳性的最终确定初发酵EMB平板检验产酸产气或产酸不产气典型菌落革兰氏染色：G－、无芽孢、杆菌者阳性①深紫黑色，具有金属光泽的菌落；②紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；③淡紫红色，中心色较深的菌落。复发酵：产酸产气结果报告根据证实为总大肠菌群阳性的管数，查MPN（most-probablenumber，最可能数）检索表，报告每100mL水样中的总大肠菌群最可能数（MPN）值。15管发酵法结果见P370。5管发酵法结果见下表。5个10mL管中阳性管数MPN5个10mL管中阳性管数MPN02.239.212.2416.025.1516（二）滤膜法用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤水样，将滤膜贴在选择性培养基上37℃培养24h，能形成特征性菌落的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌以检测水中总大肠菌群的方法。有可能在30h内完成受水中悬浮物的影响目前在一些大型水厂有应用病毒：专性活细胞内寄生——必须是相应的活敏感细胞水质检测中使用猴子的肾脏空斑形成单位（Plaque-formingunit,PFU）：每毫升样品中所含有的具侵染性的病毒（噬菌体）粒子数。三、病毒的检测方法每升水中无1个病毒蚀斑（PFU）饮用才安全。单层细胞培养计数蚀斑蚀斑数＝试样中病毒数动物病毒的检测方法软琼脂病毒试样噬菌斑：由于噬菌体的作用而使布满细菌细胞的菌苔上，出现肉眼可见的一个个透亮的小圆斑。四、噬菌体的检测方法琼脂平板软琼脂+宿主菌液+噬菌体试样培养10余小时计数噬菌斑噬菌斑数＝试样中噬菌体数双层平板法五、原生动物的检测方法主要是指对隐孢子虫卵囊与贾第鞭毛虫孢囊目前国标中规定的是：US-EPA1623方法两虫的检测对设备要求较高，检测费用也比较高