菊花的组织培养(1)

通过初中的学习，我们已经了解到大多绿色开花植物都是靠种子来繁殖的。那么，有没有不用种子来培育植物的方法呢？组织培养营养繁殖扦插嫁接压条扦插嫁接压条愈伤组织胚状体1958，美国，斯图尔德植物组织培养离体回顾知识（二）思考这个试验说明了动物已经分化的细胞核具有什么特性？高度分化的动物体细胞的细胞核有发育成完整个体的潜能多利羊的诞生动物细胞有没有这种能力？已经分化的细胞，仍然具有发育成完整个体的潜能。即细胞的全能性思考为什么已经分化的细胞具有全能性呢？生物体的每一个细胞都是由同一个受精卵有丝分裂而来的，所以高度分化的细胞含有保持物种发育所需要的全套遗传信息植物组织培养技术动物的克隆技术一、植物组织培养的理论基础（课本P32）当植物细胞脱离了原来所在植物体的器官或组织而处于离体状态时，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。植物组织培养原理：植物细胞的全能性1、培育无病毒植株2、大规模培养愈伤组织（提取紫草素，治疗烫伤和割伤的药物以及染料和化妆品的原料）4、基因工程中亦需用到植物组织培养的方法（受体细胞为植物细胞）植物组织培养的应用：3、人工种子（解决有些作物品种繁殖能力差，结子困难或发芽率低等问题）菊花的组织培养1.什么叫细胞分化？2.愈伤组织的细胞有什么特点？3.什么叫脱（去）分化、再分化？4.如何控制细胞的脱分化与去分化？（阅读32-33页第一段解决下列问题）二、植物组织培养的基本过程愈伤组织三、掌握几个概念外植体:用于离体培养的植物器官或组织片段.细胞分化：植物的个体发育过程中，细胞在形态、结构和生理功能上都会出现稳定性的差异，形成这些差异的过程叫做细胞分化。愈伤组织：离体的植物组织或细胞，培养一段时间后，会通过细胞有丝分裂，形成愈伤组织。愈伤组织的细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。脱分化（去分化）：由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化或者叫做去分化。再分化：脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化。二、植物组织培养的基本过程离体器官、组织或细胞脱分化愈伤组织再分化根、芽植物体影响植物组织培养的因素1、外植体的影响1）不同的植物组织培养的难易程度差别很大，容易进行无性繁殖的植物也容易进行组织培养。2)同一种材料，材料的年龄，保存时间也有影响。幼龄、保存时间短的材料容易培养成功。菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝，因为这种嫩枝生理状态良好，易诱导脱分化和再分化。2、营养因素的影响：MS培养基主要成分包括：大量元素N、P、S、K、Ca、Mg等无机物微量元素Fe、Mn、B、Zn、Mo、Cu、Co、I等有机物：甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等植物激素：生长素、细胞分裂素、赤霉素等讨论：你能说出各种营养物质的作用吗？同专题2中微生物培养基的配方相比，MS培养基的配方有哪些明显的不同？（P83、84）答：微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养不同，MS培养基则需提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类。3、激素的影响在配置好的MS培养基中，常常需要添加植物激素，最常用的是生长素和细胞分裂素。它们是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键因素。生长素的作用：促进细胞伸长。细胞分裂素的作用：促进细胞的分裂、生长和发育。1)按照不同的顺序使用这两类激素，会得到不同的实验结果。2)当同时使用这两类激素时，两者用量的比例影响植物细胞的发育方向（课本P33）所以植物激素的浓度、使用的先后顺序以及用量的比例等都会影响实验结果。注意:不是所有外植体都需要植物激素，菊花嫩枝的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素。4、消毒和灭菌对植物组织培养的影响如外植体的消毒、器械的灭菌不彻底会导致整个实验前功尽弃。5、其它因素的影响PH5.8左右温度18~22℃光照一般前14d进行暗培养，形成愈伤组织后进行光照，因为叶片中的叶绿素只有在有光照的条件下才能形成，一般光照12h/d。植物组织培养过程:离体组织或细胞植物体脱分化细胞分裂素≈生长素愈伤组织芽根细胞分裂素生长素细胞分裂素生长素再分化植物细胞培养不需要光需要光影响植物组织培养的因素材料的种类、年龄及保存时间长短等营养植物激素消毒和灭菌PH、温度、光照等条件五、实验操作1、植物组织培养的操作流程制备MS固体培养基外植体的消毒接种培养移栽栽培2、各步具体操作及注意事项（1）MS固体培养基的配制1）配制各种母液（为什么？）①无机物中大量元素浓缩10倍，微量元素浓缩100倍，常温保存②激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按1mg/ml的质量浓度单独配制成母液③用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量2）配制培养基①配制培养液②调PH③培养基的分装分装到锥形瓶中，每瓶分装50ml或100ml，由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素3）灭菌分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌1、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝（2）外植体消毒2、消毒①流水冲洗菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右②酒精处理用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70％的酒精中摇动2－3次，持续6－7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗③消毒液处理取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分数为0.1％的氯化汞溶液中1－2min，取出后在无菌水中至少清洗3次，漂净消毒液注意事项：1.在消毒过程中，我们既要考虑药剂的消毒效果，又要考虑外植体的耐受能力，不同药剂不同植物材料甚至不同器官要区别对待。2.外植体灭菌用过的有毒药品要妥善处理（氯化汞）以免引起环境污染。一般收集后统一交给有关专业部门处理。思考题：为什么要对外植体进行一系列的消毒？对外植体的消毒需要注意什么？外植体材料的体积小抗性很差，刚取回来的外植体带有很多微生物，如果不进行一系列的消毒，这些微生物就会与外植体竞争营养物质，同时会产生一些有害物质，因此要对外植体进行一系列的消毒。对外植体的消毒既要考虑药剂的消毒效果，又要考虑外植体的耐受能力。（3）接种污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种室消毒是至关重要的。接种前用70％的酒精喷雾使空气消毒，用70％酒精或新洁尔灭擦拭一遍工作台并用紫外线照射20分钟。工作台消毒后，首先点燃酒精灯。1、接种室消毒2、无菌操作要求所有操作都要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。3、材料的切取和接种（课本P34页）4、接种注意事项①每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为70％的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种②外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜3－4块，菊的茎或叶6－8块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件③插入时应注意方向，外植体的形态学上端朝上，不要倒插。4.培养：1.将接种后的锥形瓶及对照组放在无菌培养箱中进行培养，并且定期消毒，温度控制在18~22℃，前14天进行暗培养，愈伤组织形成后每天光照12h，愈伤组织为乳白色或黄色的瘤状2.愈伤组织形成后，更换培养基进行丛芽培养3.再更换培养基进行生根培养就能得到完整的植株。思考题：1.为什么愈伤组织形成后需要光照？答：愈伤组织形成后进行丛芽培养,培养中会形成叶片，而叶片中叶绿素的形成需要光照。2.为什么植物组织培养过程中需要更换培养基？答：愈伤组织形成后培养基中的营养也几乎耗尽，生根培养和丛芽培养所需的激素的量或比例也不一样，因此需要更换培养基。5.移栽：移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日1、打开封口膜2、清洗转移用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间3、移栽幼苗长壮后，移栽到土壤中注意事项：移栽过程中既要充分清洗根系表面的培养基，又不能伤及根系。6.栽培：将幼苗移栽后每天观察并记录幼苗生长情况，适时浇水，施肥，直至开花。正常苗污染苗1、外植体带菌2、培养基及接种器具灭菌不彻底3、接种操作时带入4、环境不清洁污染途径思考：植物组织培养的整个操作过程中如何实现无菌环境？（1）器械及培养基的灭菌（高压蒸汽灭菌）（2）外植体的消毒（70%酒精、0.1%氯化汞）（3）接种的无菌操作（酒精、酒精灯、灼烧）（4）无菌培养箱中培养（5）移栽到消毒的环境中生存一段时间思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实验吗？答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。三、课题延伸1、一般来说，容易进行无性繁殖的植物，也容易进行组织培养2、实例：芦荟、豆瓣绿、秋海棠、月季