第三章-柱色谱

•柱色谱的原理柱色谱流出曲线；柱色谱的分离效能指标；柱色谱在有机化合物中的应用。•柱色谱的方法：吸附柱色谱；分配柱色谱；离子交换柱色谱；凝胶柱色谱；亲和柱色谱。第三章柱色谱第一节柱色谱的原理一、柱色谱的分离原理柱色谱法是指将待分离混合物均匀地加在装有固定相的柱子（玻璃或金属制成）中，再加适当的溶剂（称洗脱剂）冲洗，由于试样中各组分在两相中的分配不同，在柱中随流动相移动的速度不同，通过分段定量收集洗脱液而使各组分得到分离。第一节柱色谱的原理第一节柱色谱的原理二、柱色谱的分离参数1、分配系数2、柱色谱流出曲线色谱流出曲线的意义：•指明样品的组成情况和提供样品中单组份的最少个数；•说明色谱柱的分离情况：柱效，选择性和分离度•提供单组分的定性和定量依据mscc溶质在流动相中的浓度溶质在固定相中的浓度K混合组分的分离过程及检测器对各组份在不同阶段的响应第一节柱色谱的原理effeffbrreffnLHWtWtn;)(16)(54.5222/1ABAB'r'rKKkk)A(t)B(t二、色谱柱的分离效能指标1、柱效能2、选择性3、分离度WttWWttWWttRrrbbrrbbrr)()(2)(211212122121第一节柱色谱的原理三、柱色谱在有机化合物中的应用1、分离混合物：将含有结构相似、理化性质相近的几种成分的混合物分开。2、精制化合物：在提取分离有效成分时，去除结构类似的杂质。3、鉴定化合物：在一定条件下，纯的有机化合物有一定的保留值，利用标准品的对照通过色谱法来确定化合物。第一节柱色谱的原理按分离原理可将柱色谱分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱等。现在作分别介绍。一、吸附色谱1、基本原理：（1）物理吸附又称表面吸附，是因构成溶液的分子（含溶质及溶剂）与吸附剂表面分子的分子间里的相互作用所引起的。a)基本规律：“相似者易于吸附”。b)基本特点：无选择性、可逆吸附、快速。c)基本原理：吸附与解吸附的往复循环。d)三要素：吸附剂、溶质(被分离物)、溶剂。第二节柱色谱的方法（2）化学吸附a)基本特点：有选择性、不可逆吸附。b)基本原理：产生化学反应。酸性物质与Al2O3发生化学反应；碱性物质与硅胶发生化学反应；Al2O3容易发生结构的异构化，应尽量避免。第二节柱色谱的方法（3）半化学吸附1）基本特点：介于物理吸附和化学吸附之间。2）基本原理：以氢键的形式产生吸附。如聚酰胺对黄酮类、醌类等化合物之间的氢键吸附，力量较弱，介于前两者之间，也有一定的应用。第二节柱色谱的方法2、影响吸附柱色谱分离效果的因素吸附剂的性质溶剂的极性被分离物质的极性3、吸附柱色谱的操作技术色谱柱、吸附剂和洗脱剂的选择4、应用实例黄酮类化合物的分离P108第二节柱色谱的方法返回吸附剂的种类和性质吸附剂的一般要求：较大的表面积与一定的吸附能力。不与展开剂其化学变化，不与待分离的物质产生反应或催化、分解或缔合，颗粒均匀。极性强弱的判断(与功能基的种类、数目多少和排列方式有关)：亲水性基团与极性成正比，亲脂性基团与极性成反比；游离型化合物极性弱、具亲脂性，解离型化合物极性强、具亲水性；溶剂的极性—依据介电常数来决定。吸附剂的种类和性质（1）极性吸附剂硅胶，氧化铝均为极性吸附剂，特点为：a)对极性物质具有较强的亲和能力，极性强的溶质将被优先吸附。b)溶剂极性较弱，则吸附剂对溶质将表现出较强的吸附能力。溶剂极性增强，则吸附剂对溶质的吸附能力随之减弱。c)溶质即使被硅胶、氧化铝吸附，但一旦加入极性较强的溶剂时，又可被后者置换洗脱下来。吸附剂的性质极性和非极性吸附剂活化硅醇基酸性吸附剂硅胶HClSiROSiiClSROHSi)(RSiClSiOHSi)(ROSiOHROHSi)(33RMgClRLiSOClSOCl22硅烷化方法三先氯化方法二硅酯化方法一或吸附剂的性质氧化铝极性吸附剂碱性Na2CO3中性酸性稀HCl；稀HNO3吸附剂的种类和性质（2）聚酰胺不溶于水和有机溶剂，以氢键吸附（酰氨基与酸类、酚类等），半化学吸附。聚酰胺分子中有许多酰胺基，聚酰胺上的C=O与酚基，黄酮类、酸类中的-OH或-COOH形成氢键。酰胺基中的氨基与醌类或硝基类化合物中的醌基或硝基形成氢键。由于被分离物质的结构不同，或同一类结构化合物中的活性基团的数目及位置的不同而是之于聚酰胺形成氢键的能力不同而得到分离。吸附剂的性质分离酚类、醌类、黄酮类化合物分离极性和非极性物质酰氨基氢键吸附聚酰胺吸附剂的种类和性质（3）活性炭活性炭为非极性吸附剂，故与硅胶、氧化铝相反，对非极性物质具有较强的亲和能力，在水中对溶质表现出强的吸附能力。溶剂极性降低，则活性炭对溶质的吸附能力也随之降低。吸附剂的吸附力一定时，溶质极性越强，洗脱剂的极性越弱。吸附剂的性质活性碳非极性吸附剂极性基团多极性基团少芳香族脂肪族大分子量小分子量返回根据介电常数作判断介电常数高，洗脱能力大。与被分离物质的极性有关与所选用的吸附剂性质有关化合物的极性强弱由其存在状态（游离型或解离型）所决定，并受溶剂pH值的影响。对于极性吸附剂，溶剂的介电常数越大，极性也越大，洗脱能力就越强；对于非极性吸附剂，情况正相反。返回中等极性的吸附剂弱极性的洗脱剂极性较强的洗脱剂中等极性的洗脱剂极性较强的吸附剂极性较弱的吸附剂被分离物质中等极性的物质极性较强的物质极性很小且不含氧的物质/含氧的非极性物质＋＋＋返回色谱柱的选择柱的直径与高度比为1:10～1:40，一般装样品的30～50倍量的吸附剂。吸附剂原理使用范围氧化铝亲水性吸附剂，吸附能力强分离亲脂性成分，碱性物质硅胶亲水性吸附剂，吸附能力比氧化铝弱分离亲脂性成分或亲水性成分，酸性物质聚酰胺酰氨基可与酚类、酸类等成分形成氢键分离黄酮类、蒽醌类、酚类、有机酸类、鞣质等。活性炭疏水性吸附剂水溶性成分，如氨基酸、糖和苷等。先作薄层色谱或纸色谱预实验；混合溶剂；梯度洗脱。返回大孔树脂柱分配色谱二、分配色谱1、原理：由各待测物在互不相溶的两溶液中的分配系数不同而得到分离的方法。2、流动相：为防止固定相的流失，流动相与固定液极性应相差越大越好。1）正相分配柱色谱：以水或亲水性溶剂为固定相，与水不相混溶的有机溶剂作移动液相的分配色谱。流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离。2）反相分配柱色谱：以亲脂性有机溶剂作固定相，以水或亲水性溶剂作移动相的分配色谱。流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离。3、分配柱色谱分离条件的选择1）支持剂的选择：溶剂、被分离物质、固定相液体。2）固定相的选择：分离亲水性成分/亲脂性成分。3）洗脱剂的选择：先用相应的薄层色谱结果选定，正相/反相分配色谱。4、分配柱色谱的操作技术装柱；加样；洗脱。5、分配柱色谱的应用分配色谱现要分离一含A和B的样品，A的极性小于B，固定相为Permaphase-ETH（即硅胶－脂肪醚基聚合键合相），而流动相有两种可供选择（1）甲醇－水（35：100）（2）二氧杂环己烷－己烷（1：99）。其他操作条件类似。试问下列情况下，应选什么作流动相，出峰顺序如何？为什么？1、大量A中含有微量B；2、大量B中含有微量A。分配色谱正相色谱低极性流动相反相色谱高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间待测物极性：ABC正、反相色谱中极性和保留时间的关系分配色谱三、离子交换色谱此法适于如蛋白质、氨基酸、核酸、生物碱、有机酸及酚类化合物等的分离。1.原理：利用待测离子对固定相的亲和（或离子交换）能力的差别来实现分离。待测离子与离子交换树脂固定相上带电荷基团或游离的离子发生可逆交换反应：ClXNRRXClNR-R:HMSORMHSO-R:33-3-3阴离子交换阳离子交换离子交换色谱2.固定相1）按离子交换剂类型分四种：类型官能团强阳离子交换剂-SO3-阳离子交换剂弱阳离子交换剂-CO2-强阴离子交换剂-NR3+阴离子交换剂弱阴离子交换剂-NH2+离子交换色谱2）按结构分：a）多孔型；b）表面多孔型；c）离子交换键合相微孔型大孔型微孔微孔薄膜型表面多孔型离子交换层惰性核惰性核离子交换剂硅胶层涂覆离子交换色谱3.流动相离子交换色谱流动相为盐类缓冲溶液(有一定pH和离子强度)，通过改变pH、缓冲剂类型、离子强度、加入有机试剂和配位剂等条件来控制分配比k。思考：采用离子交换色谱分离酚类样品时，流动相pH从比它的pKa小一个单位，改变到大一个单位时，该酚的保留值变化情况是什么？为什么？思考：离子交换色谱法中，流动相常以无机盐的缓冲液为流动相。请问缓冲液的pH值及离子强度对分离各有何影响？离子交换色谱5、离子色谱(IC)和离子对色谱法（IPC）1）离子色谱由于流动相都是强电解质，其电导率比待测离子约高2个数量级，这种强背景电导会完全掩盖待测离子信号。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，高背景电导的流动相转变为低背景电导，从而用电导检测器检测各种离子的含量。该法的缺点为：抑制柱要定期再生、谱峰在经抑制柱后会展宽，降低分离度。离子色谱离子色谱抑制器的作用离子色谱思考：IC分离中，何为抑制柱？分析阴离子时，抑制柱中应填充何种离子交换树脂？离子色谱电化学抑制器的工作原理((阴离子)•抑制器的主要作用：•安装在电导池之前；•提高待测离子的电导率：提高灵敏度；•Na+,Cl-→H+,Cl-•降低背景电导(淋洗液):减少噪音。•Na+,HCO3-→H2CO3•Na+,OH-→H2O离子色谱2）离子交换色谱柱的应用（1）无机的阴阳离子阴离子：F，Cl，NO3,SO4；阳离子：Li，Na,K,NH4等（2）小分子的极性化合物：有机酸：甲酸，乙酸，丙酸，柠檬酸，草酸等有机胺：甲胺，乙胺，乙醇胺，三甲胺等（3）在强碱性溶液中成离子状态（a）糖、糖醇、醇：pKa在12-14之间的弱酸，在10-200mmol的NaOH溶液中全部离子形式存在（b）氨基酸：两性离子，在强碱介质中可以形成离子离子交换色谱离子交换分离机理离子交换色谱价态的影响离子交换色谱离子半径的影响离子交换色谱极化程度的影响离子交换色谱分离阴离子离子交换色谱分离阳离子离子交换色谱3）离子排斥色谱法的分离机理：1.Donnan排斥作用－Donnan膜的负电荷层排斥完全离解的离子型化合物，仅允许未离解的化合物通过2.吸附－保留时间有机酸的烷基键的长度有关。通常烷基键越长，其保留时间也越长。3.空间排阻－与有机酸的分子量大小及交换树脂的交联度有关离子色谱离子排斥法分离机理离子色谱离子排斥法分离有机酸离子色谱4）离子对色谱法离子对色谱主要用来分离强极性有机酸和有机碱。将与待测物离子A电荷相反的离子B（称为对离子或反离子）加入到流动相（常为有机相）中，使待测离子A与离子B形成离子对AB，该AB离子对的性质与A离子或B离子的性质不同，即间接改变了待测离子的保留特性。思考：有一强极性有机酸混合物，若用离子对色谱法分离，请问在流动相中应加入阴离子还是阳离子来开成离子对？离子对色谱反相离子对（流动相离子色谱）分离机理离子对色谱反相离子对的分离机理：1.生成离子对－待测离子与离子对试剂生成中性““离子对”分布于固定相与流动相之间，其分离类似传统的反相分离2.动态离子交换－离子对试剂的疏水部分吸附于固定相形成动态的离子交换表面，其分离机理类似于离子交换。3.离子间相互作用－除包括以上两种分离机理和固定相表面双电层结构的分离机理。离子对色谱凝胶柱色谱四、凝胶柱色谱法尺寸排阻色谱1.分离原理：凝胶内有一定大小的空穴，分子体积大的待测物不能渗入孔穴中而被排阻，较早地被洗出来，小分子则完全渗透。凝胶柱色谱2．载体在水中不溶、但可膨胀的球型颗粒，具有三维空间的网状结构。3．凝胶色谱分类凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）。4.凝胶色谱柱操作技术1）固定相和流动相的选择2）操作技术5、凝胶色谱柱的应用分离肽的混合物（P99图4－14）思考题：凝胶色谱法和其他