总RNA的提取和RT-PCR

总RNA的提取、定量与RT-PCR南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心完整RNA的提取和纯化,是进行RNA方面的研究工作如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。掌握从细胞中提取总RNA的方法熟悉紫外吸收法检测RNA浓度与纯度的原理及测定方法掌握RT-PCR基因扩增的原理和过程目的实验流程提取原理操作步骤逆转录原理操作步骤提取总RNA定量合成cDNA第一链原理体系引物选择PCR电泳原理电泳步骤电泳计算方法操作步骤第一部分细胞总RNA的提取及定量原理10-5mgRNA/细胞mRNA3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)结构，可用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。RNA分离的方法：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。rRNA80-85%：28S18S5StRNA,snRNA10-15%mRNA1-5%Trizol的主要成分Trizol是一种新型总RNA抽提试剂主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在上层水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。原理所有RNA的提取过程中都有五个关键点：1.样品细胞或组织的有效破碎；2.有效地使核蛋白复合体变性；3.对内源RNA酶的有效抑制；4.有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；5.对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。关键点RNA酶污染来源RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。严格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂的污染。最大限度地抑制内源性的RNA酶：而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。防止RNA酶污染的措施1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高压灭菌。3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。4.配制的溶液应尽可能用0.1%DEPC在37℃处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经滤膜过滤除菌。5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6.设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。加样枪的使用操作步骤样品处理提取组织RNA时，每50～100mg组织用1mlTrizol试剂对组织进行裂解；悬浮细胞先离心沉淀，每5-10×106个细胞加1mlTrizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。培养贴壁细胞不须消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按10cm2/ml比例加入。(注意：匀浆一定要彻底，是提取高质量RNA的前提；细胞数量与Trizol的比例，细胞的数量不能过多。)实验材料：HEK293人胚肾细胞操作步骤1.细胞中加入1mlTrizol（RNAisoPlus）用移液枪反复吹吸直无明显沉淀后，室温放置5min，使其充分裂解。（注意：此时可放入-70℃长期保持。）2.按200ul氯仿/mlTrizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置2-3min。(注意：此步一定要振荡混匀，使氯仿和Trizol不分层。)3.4℃12,000g离心15min。样品分为三层：底层为黄色（红或绿）有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用Trizol试剂的60％。（此步开始组长负责组织各组同步进行离心）4.吸取上层水相，至另一新的离心管中。一般400-450ul就足够了，千万不要贪多！（注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱，若只提RNA，则弃下层酚相。）操作步骤5.加入等体积异丙醇后，上下颠倒混匀，4℃放置5min。6.4℃12,000g离心10min，弃上清，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。7.加入1ml75%乙醇，（切勿触及沉淀！）温和振荡离心管，悬浮沉淀。8.4℃12,000g离心5min，尽量弃上清。9.室温晾干或真空干燥5min。（注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。）10.加入10ul无RNase的水，充分震荡混匀。原理：1.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应2.而且物质对光的吸收是具有选择性的3.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱因此不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系.紫外光吸收法紫外吸收检测RNA的浓度RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40μg/ml的单链RNA。用双蒸水稀释RNA样品n倍并以双蒸水为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度:RNA(mg/ml)=40×OD260读数×稀释倍数(n)/1000dsDNA(双链DNA)1OD260=50ug/mlssDNA(单链DNA)1OD260=33ug/mlRNA1OD260=40ug/mlRNA纯品的OD260/OD280的比值为2.0，故根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度。若OD260/OD280小于2，说明可能有DNA片段污染，可以考虑用无RNase的DNase处理样品，若小于1.8，说明样品中还可能含有蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化RNA。若比值太高（大于2.2），则提示RNA有降解。紫外吸收检测RNA的纯度RNA完整性检测完整的RNA的甲醛电泳可明显地观察到28S和18S两条带，并且28S大约是18S的两倍宽。若两条带不明显,则说明RNA部分降解,可能的原因是污染了RNase。常见问题分析RNA得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底。B.RNA沉淀未完全溶解。A260/A2801.65：A.RNA应使用TEBuffer稀释后再进行吸光度值的测定。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高。B.样品匀浆时加的试剂量太少。C.匀浆样品时未在室温放置5分钟。D.吸取水相时混入了有机相。E.RNA沉淀未完全溶解。RNA降解A.组织取出后没有马上处理或冷冻。B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃。C.细胞在用胰酶处理时过度。D.溶液或离心管未经RNase去除处理。E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5。DNA污染A.样品匀浆时加的试剂量太少B.样品中含有有机溶剂(如乙醇，DMSO等)，强缓冲液或碱性溶液常见问题分析第二部分逆转录-聚合酶链反应(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR)提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。原理1.鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。在长时间的逆转录过程中，不会造成模板的降解，获得cDNA的几率大，适用于较长的cDNA链的合成。2.禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。3.Thermusthermophilus、Thermusflavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。4.MMLV反转录酶的RNaseH-突变体：商品名为Superscript和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。（一）反转录酶的选择1.随机六聚体引物：用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。2.Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。3.特异性引物：是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。（二）引物的选择（三）内参的设定为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参照基因的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。常用的内参有GAPDH（3-磷酸甘油醛脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一、各孔间的温度差等所造成的误差。仪器和主要试剂1.基因扩增仪、微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管2.总RNA3.第一链cDNA合成试剂盒（含有逆转录酶、RNA酶抑制剂、缓冲液）4.dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mmol/L操作步骤采用TaKaRaPrimeScriptRTreagentKit合成cDNA第一链按下列组分配制RT反应液1.5XPrimeScripBuffer2ml2.PrimeScriptRTEnzymeMix0.5ml3.OligodTPrimer(50mM)0.5ml4.Random6mers(100mM)0.5mlTotalRNA6.5ml反转录反应条件如下37℃60min（反转录反应）85℃5sec（反转录酶失活反应）注：反转录步骤在PCR仪中进行第一链cDNA2mlPerfectShotTaq(绿色)10ml上游引物(10mM)1ml下游引物(10mM)1mlRNasefreeH2O6ml总体积20ml取0.2mlPCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头)：如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪(PCR仪)上.PCR反应体系①94℃预变性5分钟后开始以下循环②94℃30秒60℃30秒30循环72℃40秒③72℃5分钟④4℃保温实验过程约1小时30分钟PCR参数设置琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动.DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系).琼脂糖凝胶电泳原理影响迁移速率因素1、DNA的分子大小2、琼脂糖浓度3、DNA分子的构象4、电源电压5、嵌入染料的存在6、离子强度影响琼脂糖凝胶电泳原理实验材料1.电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。2.染料：Gelv