《生物技术实践》复习课件

微生物的分离和培养酶的研究与应用DNA和蛋白质技术一、微生物的培养与分离㈠微生物的培养与分离培养基的配制微生物的分离——纯化大肠杆菌的操作㈡某种微生物数量的测定土壤中分解尿素细菌的分离与计数㈢培养基对微生物的选择作用分解纤维素的微生物的分离㈣利用微生物进行发酵来生产特定的产物果酒、果醋、腐乳的制作㈤发酵过程中亚硝酸盐含量的测定制作泡菜并检测亚硝酸盐含量㈠微生物的培养：1.培养基培养基的种类依据物理性质、化学成分、用途划分培养基的营养碳源、氮源、水、无机盐配制培养基的操作：倒平板与平板倒置制备牛肉膏蛋白胨固体培养基计算（配方比例）称量（各种成分）溶化（琼脂）调整pH灭菌倒平板①②③④2.灭菌与消毒方法及对象灭菌方法：灼烧、干热、高压蒸汽、过滤灭菌法灭菌对象：培养基、培养皿、接种用具等消毒方法：煮沸消毒、巴氏、酒精、过氧乙酸、紫外线消毒的对象：操作台、操作空间、操作者的衣着和双手3.接种纯化大肠杆菌的操作—⑴平板划线法平板划线操作五区划线法倒置培养皿⑵稀释涂布平板法①系列稀释操作②涂布平板操作：4.培养——恒温培养箱培养：放在培养箱中，适宜恒温、氧气、二氧化碳的含量5.观察——菌落：菌落群体结构特征：菌落的形状、大小、边缘、光泽度、隆起度、透明度等是菌种鉴定重要依据菌落的观察二、某种微生物数量的测定：——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数1.选择菌种2.梯度稀释培养菌液3.稀释涂布接种4.统计菌落数目：样品稀释度足够高时，一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌（不是绝对的）。实验至少要涂布三个平板作为重复组一般选择菌落数在30～300的平板计数每克样品中的菌落数＝平均菌落数÷稀释液的体积×稀释的倍数稀释涂布平板法鉴别培养基—固体选择培养基—液体三、培养基对微生物的选择作用——分解纤维素微生物的分离四、利用微生物进行发酵来生产特定的产物㈠果酒和果醋的制作果酒果醋实验原理酵母菌无氧分解葡萄糖产生酒精醋酸杆菌有氧分解葡萄糖、乙醇产生醋酸实验设计操作过程挑选葡萄→冲洗→榨汁→酒精发酵→→醋酸发酵无氧↓1-3周↓有氧10天左右生成果酒生成果醋结果评价成分鉴定3mol/LH2SO43滴、饱和重铬酸钾溶液3滴，酒精与重铬酸钾反应呈现灰绿色或通过嗅味和品尝观察菌膜、嗅味、品尝，检测和比较醋酸发酵前后的pH、显微镜观察。１.实验原理用豆腐由多种微生物（主要毛霉）参与发酵制成毛霉等微生物产生的以蛋白酶为主各种酶发酵的最佳温度为15～18℃。2.操作条件酒精含量的控制：盐的浓度控制:水分保持在70%以下3.实验设计及操作４.课题成果评价是否完成腐乳的制作腐乳质量的评价影响腐乳质量的因素：菌种和杂菌：杂菌污染则直接影响产品的色、香、味。温度：温度影响菌丝的生长和代谢发酵时间：发酵时间影响生化反应度及生化产物的量调味品：各种酒类、糖类等辅料的多少也对口感有重要影响1.实验原理：乳酸菌无氧条件将葡萄糖分解成乳酸。泡菜中微生物将蔬菜中硝酸盐还原成亚硝酸盐，亚硝酸盐在特定的条件下会转变成致癌物——亚硝胺。用对氨基苯磺酸重氮法测量亚硝酸盐含量（紫红色）：在弱酸条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸形成重氮化合物，再与N-1-萘基乙二胺偶合，形成紫红色染料与标准显色液比较、定量分析。2.操作步骤腌制泡菜↓制备标准显色液↓制备样品处理液↓比色→结果分析计算腌制条件的控制将坛口用水封好，防止外界空气进入坛中要加一些白酒（白酒可抑制泡菜表面杂菌的生长，是一种调味剂，可增加醇香感）腌制条件的控制：温度、食盐量、腌制时间温度过高、食盐用量不足10％、腌制时间过短，容易造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加。一般在腌制10天后，亚硝酸盐的含量开始下降。３、亚硝酸盐含量的测定泡菜亚硝酸盐含量（mg/kg）=样品亚硝酸盐含量取样量（40ml滤液）比色亚硝酸含量单位：1μg=10-3mg取样量：0.4×1/2×60/500×40/100=9.6×10-3kg泡菜亚硝酸盐含量的计算观察样品颜色的变化，并与标准显色液比较，找出与标准液最相近的颜色，记录对应的亚硝酸钠含量，并计算。每隔2天测一次，将结果记录下来。4.实验结果分析1号坛2号坛3号坛1月4日0.150.150.151月8日0.600.200.801月12日0.200.100.601月15日0.100.050.201月19日0.100.05020解释数据：腌制后的前6天内，泡菜中的亚硝酸盐含量就可以达到最高峰。由于泡菜在开始腌制时，坛内环境有利于某些硝酸盐还原菌的繁殖，可以促进硝酸盐还原为亚硝酸盐。第9天后泡菜中的亚硝酸盐含量开始有明显下降。随着腌制时间的延长，泡菜中亚硝酸盐的含量又有所下降。乳酸细菌也大量繁殖，对硝酸盐还原菌产生一定的抑制作，使其生长繁殖受到影响。果酒、果醋、腐乳、泡菜相关内容比较比较果酒果醋腐乳泡菜微生物酵母菌醋酸杆菌毛霉菌乳酸菌生物类型真核原核真核原核呼吸类型兼性厌氧—酒精需氧—醋酸需氧—菌丝层厌氧—乳酸生殖类型出芽生殖分裂生殖孢子生殖分裂生殖原理无氧分解葡萄糖产生酒精。有氧分解葡萄糖、乙醇产生醋酸。毛霉分解蛋白质和脂肪，配料腌制生成腐乳香气。乳酸菌无氧分解葡萄糖产生乳酸。果酒、果醋、腐乳、泡菜相关内容比较比较果酒果醋腐乳泡菜微生物生物类型呼吸类型生殖类型原理微生物的培养与分离主要考查内容培养基的类型与配制液体、固体、选择、鉴别倒平板、平板倒置灭菌与消毒灭菌与消毒的方法与对象接种方法平板划线法、稀释涂布平板法微生物的培养温度、pH、含氧量、培养箱、天数观察结果菌落形态、菌落周围透明圈、抑菌圈等二、酶的研究与应用果胶酶在果汁生产中的作用探讨加酶洗衣粉的洗涤效果酵母细胞的固定化1.实验原理：果胶是植物细胞壁的主要成分，果胶酶和果胶甲酯酶可水解果胶，与制取果汁有关果胶酶适宜温度范围：10-50℃适宜pH值为3.2-5.0相同重量的苹果泥在不同温度或pH值下和相同时间内比较果汁产量，从而确定果胶酶的最适反应温度或pH值2.实验设计——操作步骤：设置不以温度或pH梯度探究最适温度或pH值３.观察并记录数据4.结果分析与评价曲线图形式表示不同温度或不同pH下，制作1L果汁与果胶酶用量的关系，分解果汁的最适温度和pH。如何判断果胶是否被全部分解——果胶不溶于酒精（混浊）１.原理：利用添加了蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶等酶类的洗衣粉，将蛋白质、油脂、淀粉、纤维素等类污渍水解成水溶性小分子物质。2.实验目的：探究在什么温度下使用加酶洗衣粉的洗涤效果最好探究普通洗衣粉和加酶洗衣粉对衣物污渍的洗涤效果探究添加不同种类酶的洗衣粉其洗涤效果有哪些区别３.实验设计４.结果分析与评价确定加酶洗衣粉的洗涤效果最好的最适温度比较普通洗衣粉和加酶洗衣粉洗涤效果分析各种不同品牌的加酶洗衣粉对油渍、汗渍、血渍的洗涤效果1.实验原理：酶在催化反应中易变性失活，反应后不易回收再利用，提高成本，影响产品质量。将酶固定在不溶于水的载体上，既能与反应物接触，又能与产物分离，可回收反复利用。酶是由细胞合成的，直接固定合成酶的细胞，既操作简便，又可降低成本。２.固定化细胞技术固定化酶：是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体的说，指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂固定化细胞固定化技术：将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术固定化细胞：被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞酶固定的几种方式示意图α－淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测本实验有吸附法将α－淀粉酶的固定在石英砂上。用淀粉指示剂溶液测试，流出物呈红色，表明水解产物糊精生成。三、DNA和蛋白质技术DNA的粗提取与鉴定多聚酶链式反应扩增DNA段——PCR体外扩增DNA技术血红蛋白的提取和分离1.实验原理：NaCl溶液浓度为0.14mol/L时，DNA溶解度最低——析出DNA；DNA不溶于酒精——提纯DNA；DNA遇二苯胺(沸水浴)能被染成蓝色——鉴定DNA２.实验设计：制备鸡血细胞液——柠檬酸钠提取血细胞的核物质——蒸馏水溶解DNA——2mol/LNaCl溶液析出DNA——0.14mol/LNaCl溶液提纯DNA——95％冷酒精再溶解DNA——2mol/LNaCl鉴定DNA——二苯胺鉴定3.实验设计实验材料的选择动物：鸡血（不能选择哺乳动物的红细胞）植物：菜花（用植物细胞作实验材料时需要先用洗涤剂溶解细胞膜）提取DNA的基本思路：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分DNA在酒精溶液中的溶解性DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响大多数蛋白质不能忍受60－80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质,但对DNA没有影响操作步骤①破碎细胞鸡血＋蒸馏水→搅拌→过滤→收集滤液②溶解DNA并去掉滤液中杂质2mol/LNaCl溶液＋滤液③析出DNA2mol/LNaCl溶液＋蒸馏水→0.14mol/LNaCl→DNA析出④再溶解DNA2mol/LnaCl溶液＋析出的DNA析出→滤液⑦提纯DNA：95％冷酒精＋滤液→静置２～３min→出现白色丝状物⑧鉴定DNA2mol/LnaCl溶液５mL＋白色丝状的物＋４mL二苯胺溶液→沸水浴５min→出现蓝色反应⑨设置对照2mol/LnaCl溶液５mL＋４mL二苯胺溶液→沸水浴５min→没有蓝色反应⑩观察实验结果：实验组与对照组是否变蓝1.实验原理：通过温度变化控制DNA的变性和复性，可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍通过设计相应的引物，加入四种脱氧核苷酸原料、DNA模板、TaqDNA聚合酶(耐高93℃高温)等，完成特定基因的体外复制。脱氧核苷酸结构式OOPOHO碱基OOHOOPOHOOH碱基5’3’3’5’碱基脱氧核糖磷酸基团碱基脱氧核糖碱基脱氧核糖5’3’脱氧核苷酸链间的连接dNTP四种脱氧核苷酸(dNTP)２.实验操作靶序列（目的基因）靶序列（目的基因）PCR循环第一步：加热变性PCR循环第二步：引物与靶序列退火PCR循环第三步：引物延伸第1个PCR循环完成后：得到两个拷贝的靶序列循环次数DNA数量122438201,048,576301,073,741,824上述三个步骤大约需要重复15～30次循环，循环后靶序列扩增的数量为２n４.结果分析与评价理论上DNA扩增数目的计算一条DNA，复制n次，DNA为2na条DNA，复制n次，DNA为ax2n测定DNA扩增的倍数扩增DNA含量的测定DNA含量(g)＝50×(260nm的读数）×稀释倍数50注解：在标准厚度为1cm比色杯中，OD260为1相当于50g/mL的双链DNA含量。PCR仪加热至93℃使模板DNA变性降温至55℃复性使引物与模板DNA碱基互补再升温至72℃J时，DNA沿着3’→5’复制延伸在Taq聚合酶作用下进行以四种脱氧核苷酸(dNTP)（N=ATCG）为原料,以引物为复制的起点,合成新链。子链沿5’3’方向聚合重复改变反应温度,经变性、复性和延伸三个阶段为一个循环,一般样品是经过30次循环,使基因放大了数百万倍;实验小结: