D-二聚体检测与应用

TitelmasterformatdurchKlickenbearbeitenD-二聚体的检测与应用2012.11.1临漳县医院检验科马玉海内容提要一、D-二聚体的产生及技术现状二、D-二聚体检测试剂的要求三、标准化问题四、InnovanceD-Dimer试剂五、D-二聚体检测的临床应用六、D-二聚体检测结果的解释2D-Dimer检测技术的发展史•1972年，Gaffney首先提出D-Dimer检测，可作为监测凝血性疾病的“有用的工具”。•1983年，Rylatt等首先报道了用单克隆抗体（DD-3B6/22）检测D-Dimer（乳胶凝集法）。当时被誉为“金标准”。•90年代，ELISA分析法、乳胶增强型免疫分析法等。•90年代末到本世纪初，免疫比浊法在凝血仪上实现了自动化检测。•但D-二聚体片段异源性的问题被忽略了3凝血系统内源性凝血外源性凝血凝血酶原凝血酶FXIIIFXIIIa纤溶酶原纤溶酶纤维蛋白单体纤维蛋白原交联纤维蛋白FDPX,Y,D,E等碎片X′,Ｙ′,Ｄ,Ｅ等碎片DD,DXD,DD/E,YXD等复合物一、D-二聚体的产生纤溶系统纤溶凝固5所检测的D二聚体片段D-二聚体检测的技术现状□制备单克隆抗体，针对的只是某类型D-二聚体。□病理过程中可产生多种类型D-二聚体，由于不同检测试剂只测定其中某种类型，而非降解片段的全部，因此各类试剂在对同一标本进行测定时，其敏感性显著不同。□目前，30种检测方法（20余种单克隆抗体）被应用于临床，不同试剂间差异非常显著。□无统一的国际标准D-二聚体检验方法的演变□低敏方法导致许多病理状态无法及时反映。□《急性肺血栓栓塞症诊断治疗专家共识》中华内科杂志2010年1月。□推荐…高敏感度的方法□国际上目前已经开始逐渐推动高敏方法。□原方法敏感度低：阳性率低□新方法敏感度高：阳性率高□临床：与既往的使用经验不符8二、D-二聚体检测试剂选择●高度敏感性和NPV-(几乎)无假阴性●有明确的阈值（cutoff值）适用于24小时作常规分析可用于门急诊标本分析自动化检测操作步骤简易快速的报告时间定量检测,有标准、质控物经济9检测试剂盒目前市场上用于检测D-二聚体的试剂品种有很多种，大体上可分为两种情况：一种是以欧美产品为代表，主要用于DVT/PE排除筛查特点：灵敏度高，检测范围相对较窄。另一种是以日本产品为代表，主要是用于DIC诊断特点：灵敏度相对较低，检测范围较宽10VTE(DVT/PE)exclusionDICD-Dimer•无统一的国际标准•目前有超过30种检测方法和20多种单抗被使用。•存在两种报告单位：D-dimer（DDU）和纤维蛋白原当量(FEU)•抗体对D二聚体不同片段有不同的亲和力•不同的试剂有不同的干扰情况11三、标准化问题12美国临床实验室标准化协会（CLSI）H59-P推荐指南13D二聚体试剂标准——中国国家标准（讨论稿）•4.2阴性预测值•结合临床诊断的验前概率进行D-二聚体检测，其阴性预测值应不低于95%。•4.3测试范围•涵盖制造商提供的用于排除诊断的临界值的1/2到4倍的临床标本测定值。•4.4线性•D-二聚体试剂在测试范围内，线性相关系数应大于0.98。•4.5精密度4.5.1重复性用正常质控血浆同日内重复测试所得结果的变异系数（CV）不超过15％，用高值异常质控血浆同日内重复测试所得结果的变异系数（CV）不超过10％。……144.7报告方式D-二聚体的报告单位通常包括纤维蛋白原等量单位（FEU）和D-二聚体单位（DDU）两种形式。FEU是将D-二聚体的量用降解前纤维蛋白原分子的量来表达，因此，用FEU表达的D-二聚体的量相当于用DDU表达的1.7倍。在D-二聚体报告方式中还包括ng/mL、ug/mL和mg/L等形式，通常应该直接采用制造商提供的单位，不建议进行形式和量纲的转换15四、InnovanceD-Dimer检测试剂已通过美国FDA验证（FDA510K）明确可用于静脉栓塞性疾病的排除，其阈值为0.5mg/LFEU已得到EHA，ICTH和日本病理学会接受2010年在中国成功注册1617检测原理全自动乳胶增强免疫比浊度法新一代单克隆抗体8D3检测系统•Sysmex®CA-7000system•Sysmex®CA-1500system•Sysmex®CA-560system•CSseries18检测试剂抗体试剂：REAGENT•乳胶颗粒包被•低压冻干，需蒸馏水复溶稀释液：DILUENT•液体，用于样本稀释、定标稀释•有缓冲液作用添加剂：SUPPLEMENT•液体，用于封闭非特异性抗体缓冲液：BUFFER•液体，使信号增强•含有聚合碳水化合物的缓冲液19定标品•与试剂批号匹配•有不同系统的靶值•冻干粉•人血浆为基质，所含D二聚体浓度大约为4.4mg/LFEU•定标曲线有效期6个月以上20•定标–范围:0.19–4.40mg/LFEU或更宽–自动6点定标–定标有效期达6个月以上•样本–每测试:8–15µL,单次检测•检测范围–0.19–35.20mg/LFEU–样本结果高于定标曲线范围，仪器自动稀释–样本高于检测范围，可用Innovance*D-DIMERDiluent再进行检测21质控品CONTROL1•冻干粉•正常范围，大约0.3mg/LFEU，低于参考范围和CUTOFF值CONTROL2•冻干粉•异常范围，大约3mg/LFEU，高于参考范围和CUTOFF值22试剂稳定性StabilityafterpreparationTemperatureReagentBufferSupplem.DiluentCal.Controls2to+8°C4wks4wks4wks4wks-5days-18°C8wks8wks8wks8wks-2wks+15to+25°C----4hrs6hrsOnboardstabilityBCS®/BCS®XPBCT‡Sysmex®CA-7000Sysmex®CA-1500Sysmex®CA-560Reagents48hrs48hrs48hrs24hrs8hrsCalibrator4hrs4hrs4hrs4hrs4hrsControl8hrs8hrs8hrs8hrs8hrs分析性能23抗原过剩•D-dimer在500mg/LFEU以下,和FDP在2000mg/LFEU以下都没有抗原过剩是cutoff值0.5mg/LFEU的1000倍！分析灵敏度BCS®/BCS®XPBCT‡Sysmex®CA-7000Sysmex®CA-1500Sysmex®CA-560Analyticalsensitivity[mg/LFEU]0.0700.0750.0320.0360.06824对潜在干扰物质不敏感，主要通过SUPPLEMENT来阻断非特异性抗体抗干扰能力BCS®/BCS®XPBCT‡Sysmex®CA-7000Sysmex®CA-1500Sysmex®CA-560类风湿因子[IU/mL]13301330133013301330甘油三脂[mg/dL]600600400600400血红蛋白[mg/dL]200200200100200胆红素[mg/dL]6015601512总蛋白[g/L]7575757575肝素[IU/mL]8888825Innovance*D-DIMER的参考区间及cutoff值•正常人群的百分之90分位数:0.55mg/LFEU•Cutoff值：0.5mg/LFEU•没有检测系统差异•略高于CUTOFF值•85%的正常人群的D二聚体低于0.50mg/LFEU•均值和中位数均低于CUTOFF值26271.在不同地区建立样本采集点；2.收集门诊怀疑有DVT和PE的病人样本（至少300人）；3.病人选择，采用Wells的验前概率（PretestProbabilityPTP）评估规则和影像学检查，并对阴性病人进行为期三个月的随访，以最终确诊是否患有DVT或PE；4.剔除预防或抗凝治疗的病人和孕妇；5.对所有选中的疑似患者同时进行D-二聚体检测和影像学检查；6.对D-二聚体检测结果作受试者工作特征（ROC）曲线并确定cutoff值。国外通常采用以下步骤建立cutoff值：FDA验证结果（FDA510K）28NCutoff[mg/LFEU]NfalsenegativeNPV/LCL[%]Sensitivity/LCL[%]Specificity/LCL[%]Innovance*D-DIMERSysmex®CA-700014250.50299.5/98.799.4/98.038.3/35.4Sysmex®CA-150014250.50299.5/98.799.4/98.039.3/36.9Sysmex®CA-56014250.50299.5/98.699.4/98.037.8/35.4ComparisonAssaysVIDAS®D-DimerExclusion™14250.500399.3/98.399.0/97.438.1/35.7Stratus®CSDDMR11280.450299.4/98.499.2/97.539.7/37.0LCL=Lower95%confidencelimit29结果报告结果报告的形式和单位按厂家推荐，不要对单位做任何转换不是所有的D-二聚体检测的阈值（cutoff值）都是500ug/LFEU或0.5mg/LFEU报参考区间还是报cutoff值●●●30InnovanceD-Dimer与D-DimerPlus的比较InnovanceDDD-DimerPlusFDA认证已通过（510K）没通过用于排除单抗8D3DD5报告单位mg/LFEUmg/LDDUCutoff值0.5mg/LFEU0.13mg/LDDU参考区间0.55mg/LFEU0-0.246mg/LDDU线性范围0.19-4.4mg/LFEU0.1-2.1mg/LDDU检测范围0.19-35mg/LFEU0.1-16mg/LDDU开瓶后稳定性2-8℃4周-18℃8周2-8℃2天室温5天-18℃2周抗类风湿因子、肝素1330IU/mL、8IU/mL98IU/mL、2.5IU/mLHookEffect含量在500mg/LFEU以下，无有31为什么要更换？给临床一个解释：1.高灵敏度检测D-二聚体，是检测本身的要求，也是临床评估和诊断疾病的要求2.InnovanceDD通过FDA认证，并明确用于DVT和PE排除已得到EHA，ICTH和日本病理学会接受3.选用新的单抗8D3，其灵敏度、稳定性、抗干扰能力更优4.Cutoff值的设定更科学合理，符合行业内认可“标准”5.结果报告单位，使用mg/LFEU，符合目前国际趋势6.线性范围更宽，便于临床动态观察32五、D-二聚体检测的临床应用★深静脉血栓、肺栓塞（早期排除诊断）★DIC的早期诊断和动态监测★外科手术后的血栓监测★妊高症、先兆子痫的监测★恶性肿瘤、白血病早期识别、血栓监测★肝脏疾病（重症肝炎、肝硬化）★肾脏疾病（肾病综合征、肾移植术后）★溶栓治疗评估及血栓复发的监测★心血管疾病病情评估（心力衰竭、房颤、旁路手术）★脑梗死鉴别和治疗监测331.DVT和PE的排除D-二聚体检测最大的临床价值是用于排除DVT和PE。循证医学证实其VTE和PE的排除性诊断价值。目前临床结合验前概率（pretestprobability,PTP）同时检测患者D-二聚体浓度，来排除DVT和PE。当PTP评估为低、中风险，D-二聚体检测cutoff值为阴性（0.5mg/LFEU）,即可排除DVT和PE，无需再做进一步的影像学检查。34血管造影虽是诊断DVT和PE的“金标准”，但其检查费用相对较高，且有侵入性损伤，同时还受到医院医疗水平的制约。肺部扫描和超声也可选择，但也不便作为常规筛查。D-二聚体测定简单便捷，价格低廉，特别适合对门诊病人的常规筛查。国外研究表明，D-二聚体检测结合PTP可使30-35%怀疑有DVT/PE的病人免受进一步检查，从而减少不必要的痛苦和费用。35深静脉血栓（DVT）验前概率评估规则变量评分--活动