禽流感监测技术推广应用

华中农业大学硕士学位论文禽流感监测技术推广应用姓名：熊波申请学位级别：硕士专业：兽医指导教师：金梅林;吴邻20090601禽流感监测技术推广应用作者：熊波学位授予单位：华中农业大学相似文献(10条)1.期刊论文舒跃龙.王敏.张烨.李梓.郭俊峰.郭元吉.SHUYue-long.WANGMin.ZHANGYe.LIZi.GUOJun-feng.GUOYuan-ji一种敏感的H5禽流感病毒血凝抑制试验方法-公共卫生与预防医学2007,18(2)目的建立一种敏感的禽流感病毒血凝抑制方法检测H5禽流感病毒特异性抗体.方法采用不同动物来源的红细胞,用血凝抑制试验测定H5禽流感病毒特异性抗体,比较其灵敏性.结果通过对鸡、豚鼠、马等动物红细胞的比较,发现在采用血凝抑制试验测定H5禽流感病毒抗体时马红细胞灵敏度最高.结论可以利用马红细胞建立测定H5禽流感病毒血凝抑制抗体的敏感方法,该方法可以用于人群中禽流感病毒血清抗体水平的调查.2.会议论文王可洲.佘锐萍.刘玉锋.胡艳欣.彭芳珍.马卫明兔圆小囊抗菌肽对鸡新城疫病毒及禽流感病毒血清抗体水平影响的研究2006选择90只1日龄星杂蛋鸡随机分为两组,实验组在7、14、21、28、35、42、49日龄时分别胸肌注射无菌处理过的兔圆小囊抗菌肽0.1、0.2、03、0.4、0.5、0.5、0.5mg,对照组同时分别注射相同体积的灭菌生理盐水.常规免疫后,分别于第7、14、21、28、35、42、56日龄采血分离血清,实验组及对照组均随机抽取10只,按常规方法用96孔血凝板进行血凝抑制实验(HI),分别测定NDV和AIV血清抗体的血凝抑制效价.结果显示:实验组NDV和AIV血清抗体水平均明显高于对照组(P＜0.01).表明兔圆小囊抗菌肽可显著提高鸡新城疫弱毒苗及禽流感灭活苗的抗体水平。3.期刊论文朱筱佳.李来兴.杨乐.王贵华.ZHUXiao-jia.LILai-xing.YangLe.WANGGui-hua青海湖鸟岛斑头雁种群对H5N1亚型禽流感病毒的免疫状况-动物学研究2009,30(4)斑头雁(Anserindicus)是2005年青海湖H5N1型高致病性禽流感的主要被感染物种.为了解斑头雁目前对H5N1亚型禽流感病毒(AIV)免疫状况,2008年春季,在青海湖鸟岛采集该种群弃卵(68枚)和巢卵(125枚),以血凝抑制试验(HI)检测抗H5N1亚型禽流感病毒的卵黄母源抗体(IgY).根据测试结果推断,在高致病性禽流感暴发3年后,青海湖鸟岛繁殖的斑头雁种群有26.5%～35.2%的繁殖对可能已经获得了对H5N1型禽流感病毒的免疫能力.另外,以斑头雁巢密度和抗体效价进行相关分析发现,斑头雁母源抗体水平与斑头雁巢密度正相关(r=0.736,P=0.000),表明高密度繁殖群内的母源抗体传递更具有适应性意义.4.学位论文张晓霁H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白抗原性差异的研究2007高致病力H5N1亚型禽流感的暴发不仅给世界养禽业造成巨大打击,而且给人类健康带来严重威胁,对于该病的防制具有重要的公共卫生学意义.疫苗免疫接种是防制高致病性H5N1亚型禽流感的重要手段,但禽流感病毒像所有的RNA病毒一样在传播过程中非常容易发生变异,使疫苗株与感染的病毒之间抗原差异较大而不能有效保护家禽.已知禽流感病毒的毒力和抗原性与其HA蛋白有密切关系,因此要控制禽流感首先要对毒株之间HA抗原性的差异进行研究.为此,本研究选用了4个不同年代、不同分离地点的毒株(CC毒株是04年分离于广东地区、GD毒株是96年分离于广东地区、QFY毒株是04年分离于东北地区、YC毒株是05年分离于东北地区),首先经RT-PCR扩增了4株H5N1亚型禽流感病毒的血凝素基因(HA),将其克隆到pFastBacHTA杆状病毒转座载体上,经酶切鉴定及测序筛选出阳性重组载体,将其转化DHl0Bac感受态细胞与杆状病毒穿梭载体(bacmid)进行转座,通过蓝白斑筛选和PCR鉴定获得重组杆状病毒穿梭载体(rBacmid.-H5).rBacmid-H5在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞.通过蛋白质电泳、免疫印迹法、血凝试验和血凝抑制试验分析表明:分子量约63Kd重组血凝素蛋白在sf9昆虫细胞中实现了高效表达,具有良好的血凝活性;而且其血凝活性能够被H5N1禽流感病毒高免血清所抑制,说明表达的重组蛋白具有与天然蛋白相似的生物活性.然后将所表达4种HA蛋白定量,用佐剂乳化后制成禽流感基因工程亚单位疫苗分别免疫1组3周龄SPF鸡.并在免疫后1-5周和攻毒后3周分别翅静脉采血并分离血清,将采集的血清分别用H5亚型禽流感病毒的不同毒株作为抗原进行交叉血凝抑制反应(H1)和中和试验,来检测抗体与不同毒株之间的交叉血凝抑制价和中和病毒的能力,并用A/Goose/HLJ/QFY/04毒株作攻毒保护试验以对这4株禽流感病毒的HA蛋白进行比较,从免疫水平上了解血凝素基因的差异;实验结果显示各组SPF鸡对强毒株的攻毒保护、排毒情况及对不同分离株的血凝抑制价有显著差别,GD蛋白免疫组对4个毒株的血凝抑制价最低普遍在临界保护值以下,并且对QFY毒株的攻击不能100﹪保护并有严重的排毒现象.CC和YC蛋白免疫组对QFY毒株的攻击能够全保护,但也有一定量的排毒.只有QFY蛋白免疫组对同源病毒的攻击产生非常好的保护力也没有排毒现象,而且对4种不同抗原都有较高的血凝抑制效价;从结果中可以看出96年分离的GD毒株与04/05年分离的几个毒株抗原性差异很大.CC和YC毒株的抗原性与QFY毒株也不相同,虽然能够有效保护但也会排毒.5.期刊论文刘来福.张鹤晓.张利峰.赖平安.周琦.刘环.谷强.翟培军.茅祖兴.葛曼丽家禽禽流感病毒AGID抗体定性检测及H5、H9亚型HI抗体定量检测能力验证结果分析-现代测量与实验室管理2004,12(2)通过对全国多个行业的24个实验室禽流感血清学检测技术的能力验证考核,全面了解和掌握这些实验室这方面的技术水平,为实验室认可、国际互认检测结果和领导决策提供了有力的技术数据.6.期刊论文方钟.罗文新.王明桥.陈瑛炜.张军.陈鸿霖.管轶.夏宁邵.FANGZhong.LUOWen-Xin.WANGMing-Qiao.CHENYing-Wei.ZHANGJun.CHENHong-Lin.GUANYi.XIANing-Shao高致病性禽流感病毒H5N1中和抗体的单链抗体构建与活性鉴定-生物工程学报2007,23(2)在本实验室研制出的多株针对H5N1血凝素的鼠单抗中,10F7对34株H5N1病毒株都有血凝抑制和中和活性,具有特异性高、反应性强、识别谱广的特点.通过基因工程构建10F7单链抗体(scFv)表达重组质粒,在大肠杆菌中表达并纯化scFv,经血凝抑制实验及中和实验检测其活性.结果在针对3株病毒的血凝抑制实验中,10F7scFv蛋白对其中2株H5N1病毒均显示出结合活性,而对H9毒株没有反应.在针对7株H5N1病毒的中和实验中,10F7scFv对5株病毒具有较好的中和能力.H5N1广谱中和抗体10F7的单链抗体构建,为进一步研制针对H5M禽流感病毒的治疗性抗体奠定了基础.7.学位论文廖志勇禽流感病毒（H5N1）血凝素特异性单克隆抗体的制备、鉴定及其ELISA捕获法的建立2007流感病毒属于正粘病毒科流感病毒属，是一大类引起人类和禽畜患病的病原体。根据核蛋白(N)和基质蛋白(M)的特征，流感病毒可分成甲(A)、乙(B)和丙(C)三型。乙型和丙型流感病毒感染者以人类为主，但流行范围很窄，而甲型流感病毒可感染人类、禽类及家畜，是引起流感大规模流行的主要致病原。根据病毒表面血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)抗原性的差异，还可将甲型流感病毒进一步分为不同的亚型，目前已发现的甲型流感病毒包括16个HA亚型(H1-H16)及9个NA亚型(N1-N9)，其中H1、H2、H3及N1、N2亚型是引起人类流感的主要亚型。长期以来，H1N1和H3N2亚型流感病毒引发了多次世界性流感流行，如1918年的“西班牙流感”，以及1957年和1968年的流感大流行，对人类健康造成了巨大的威胁。而自从1997年H5N1亚型禽流感病毒在香港导致18人发病及6人死亡的事件发生以后，人们开始高度重视以H5N1和H7N7亚型为代表的禽流感病毒。此后，高致病性禽流感病毒又持续多次地在东亚、东南亚及欧洲等地感染人类及家禽，为避免疫情扩散，仅亚洲各国政府就宰杀上亿只家禽，造成至少上千亿美元的损失。更为重要的是，H5N1禽流感病毒正经历迅速的变异，极有可能导致病毒在人际间的传播。由于禽流感与其他病毒引发的急性呼吸道疾病的临床症状类似，仅仅依靠临床表现难以对禽流感做出准确的诊断，必须通过实验室检测手段进行确诊。简便、快速而且适合基层单位推广的禽流感早期检测技术，可以使临床一线的医生早期、迅速、准确地作出诊断，及时对患者进行隔离，防止禽流感病毒进一步传播，在防控禽流感突发疫情中起着关键作用。目前，已有基于免疫层析法(IC)、酶联免疫吸附试验(ELIsA)等免疫检测技术的抗原快速检测试剂盒上市，可用于区分甲、乙两型流感病毒，但都无法进一步区分亚型。研究流感病毒亚型的检测技术，将禽流感病毒与普通流感病毒区分开来，不仅有利于及时开展针对性的抗病毒治疗，还有助于研究禽流感病毒亚型的流行和进化规律，监控禽流感病毒新亚型的出现，并且对开展大规模筛查，即时发现传染源和切断传染途径，都具有十分重要的意义。由于甲型流感病毒区分亚型的标准之一是血凝素的抗原性，而不同亚型病毒血凝素之间同源性不高，因此血凝素是流感病毒亚型检测的理想靶标。到现在为止，实验室流感病毒亚型检测方法中，针对血凝素的主要有血清学检测、基因检测及病毒抗原检测，但血清学方法检测的是特异性抗体，不适用于早期诊断；基因检测对操作者的技术水平要求较高，无法在基层单位普及使用；而病毒抗原检测主要是免疫荧光试验及酶联免疫吸附试验，前者需要配备荧光显微镜，只能在较大医院或研究所才能开展，而利用特异性抗体检测血凝素抗原的ELISA捕获法，能在病毒感染早期准确判断病毒的HA亚型，但是目前国内外尚无商品化试剂盒问世。本研究采用多种形式的血凝素抗原免疫小鼠，筛选具有血凝抑制活性和中和活性的特异性抗体，通过竞争抑制试验分析抗体识别的抗原表位，并利用不同宿主、不同时间分离的病毒株进行考核，最终组建双抗体夹心ELISA法，检测H5N1禽流感病毒血凝素抗原。此外，本研究制备针对血凝素的特异性单克隆抗体，不仅可以发展区分流感病毒亚型的检测方法，还可用于发展治疗性抗体。流感病毒血凝素决定了病毒的血凝活性，与病毒吸附到靶细胞表面唾液酸寡糖受体密切相关，是病毒重要的毒力决定因子。而针对病毒血凝素的具备中和活性的抗体，可以在感染早期特异性结合血凝素，使病毒失去吸附和感染宿主细胞的能力。因此，在获得具有血凝抑制活性的血凝素特异性抗体基础上，本研究进一步评价抗体对禽流感病毒的中和活性，为研究治疗性抗体奠定基础。本研究主要分为三个部分：第一部分：H5N1禽流感病毒血凝素抗原的制备和鉴定本部分研究采用三种方法获得血凝素抗原。(1)利用杆状病毒表达体系，在昆虫细胞HighFive中表达重组H5血凝素蛋白(以下简称“重组H5蛋白”)，采用免疫荧光和WesternBlot方法检测重组H5蛋白在昆虫细胞中表达情况，血凝试验检测重组H5蛋白的血凝活性。WesternBlot鉴定表达重组蛋白分子量约为66kDa，WesternBlot和免疫荧光结果证实在昆虫细胞表达的重组H5蛋白能特异性地结合H5N1禽流感病毒免疫的动物血清和H5亚型标准抗血清；血凝试验表明重组H5蛋白能使豚鼠红细胞发生凝集反应，凝集效价为1:128，证明用杆状病毒体系表达的重组H5蛋白具有血凝活性。(2)鉴定携带H5N1禽流感病毒株(A/HongKong/482/97)血凝素基因的质粒pVAX1-tpA-97-H5(以下简称“H5基因的质粒”)，利用x-gal染色试验观察pVAX1质粒载体的转染效率，通过免疫荧