薄层扫描法

薄层扫描法09中药一班薄层扫描法一、定义薄层扫描法(TLCS)又称原位定量薄层色谱扫描法（QTLC）系指用一定的波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中有紫外或可见吸收的斑点或经照射能激发产生荧光斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分值用于药品定性定量的分析方法。回顾薄层色谱法（TLC)1、薄层板的制备（硅胶板,Al2O3板，聚酰胺薄膜等）2、点样（选择合适的展开剂，在薄板底1cm处画基线，点样）3、展开（浸入展开剂，展开到距薄板顶端1~2cm)4、检视(在紫外光灯下观察斑点）了解一下薄层扫描仪薄层扫描仪的组成及主要功能薄层色谱扫描仪有多个厂家生产，型号不同，仪器外形、光路系统及某些功能也有差异，但其基本结构及主要功能是基本相同的。每台仪器都包括主机、数据处理及信号输出等部分。（1）分光器及测量范围大多数薄层扫描仪的分光器为光栅，少数为棱镜，极个别的用滤光片，其测量范围光栅为200-800nm，棱镜为200-2500nm。（2）光源及检测器光源室具有可见光源钨灯，波长范围为400-800，紫外光源氘灯波长范围为200-400nm，荧光光源为氙灯或汞灯。操作时可通过光源选择杆来变换光源选择镜的位置；检测器一般为光电倍增管。表7-5-2国外几种主要专用薄层色谱扫描仪二、TLCS基本原理与方法薄层扫描法可分为薄层吸收扫描及薄层荧光扫描两类方法。1.薄层吸收扫描法的基本原理薄层吸收扫描法是用可见光或紫外线的单色光照射展开后的薄层色谱板，测定薄层色谱斑点(简称斑点)的吸光度(A)随展开压离(L)的变化，而获得A—L成A—Rf曲线，即薄层色谱扫描图(简称扫描图)。曲线上的色谱峰峰面积可用于定量分析。由于薄层板存在着明显的散射现象，而使斑点中物质的浓度与吸光度的关系不服从Beer定律，所以需田Kubelka—Munk(古柏尔卡—曼克)理论来描述。该方程式是薄层扫描法的定量分析基础。定量校正方法可分为曲线校直法及非线性回归法等。设薄板固定相的厚度为X,入射光的强度为I.,当透过厚度x的的固定相后，照射在微分薄层厚度dx上的入射光强与反射光强分别为i和j时，如左图。其入射光强的增量与反射光强的增量分别符合以下两个微分方程：即光照射到厚度为x的薄层后，光被吸收及散射。在入射方向，光强度因为被吸收与散射而减弱；在入射的反方向，则光强度因散射而增强。解上述方程得：在薄层扫描时，人们只是对进入薄层和由薄层出来的光有兴趣，也即上式的极端情况，x=0及x=X时对比两图很易发现，由于薄层固定相的散射作用使在透射法中所测得的斑点的吸光度产生正偏差，而在反射法测定时产生负偏差。这是因为照射光被散射，降低了透射率，吸光度增加；散射光增加了反射光光强，增加了反射率，而降低了吸光度的缘故。其次，还可发现后图比前图的横座标大25倍，这说明了反射法的灵敏度(响应值)比透过法小。1·1Kubelka-Munk曲线校直Kubelka－Munk曲线说明了薄层色谱斑点的吸光度与其浓度间呈非线性关系，该曲线是薄层扫描法进行定量分析的理论依据。曲线处理采用两类方法：曲线校直法及计算机回归法(线性及非线性回归)。CS系列仪器采用前者，CAMAG仪器采用后者方法。曲线校直法是根据薄层板的散射参数SX值，将Kubelka－Munk曲线校正为直线，简化A与KX间的关系，以利于定量分析。用曲线校正法校直Kubelka—Munk曲线，必须巳知薄层板的SX值，Mrck预制硅胶板的SX＝3，Merck预制氧化铝板的SX＝7，Wako预制硅胶FM(硅胶GF254)板的SX＝7。国产预制薄层板及自制薄层板，可参考上述数据试调，而后检查校正是否适宜，修正SX值再校，直至A—KX曲线成直线为止。检查方法如下图所示。图中点样量显(横坐标)常用单位为ug/点。应用时应注意：曲线校直法是一种简便的薄层扫描定量校准方法，但比较粗糙，且有时难于准确知道薄层板的SX值。为了降低定量误差，应使标准品的色谱峰峰面积与待测品(供试品)的色谱峰面积尽量接近为好。2.薄层吸收扫描法的扫描方式及条件的选择薄层吸收扫描法的扫描条件，包括扫描方式、波长及测光方式等。扫描方式分为直线式及锯齿式扫描。扫描波长的选择至关重要，不仅关系检测灵敏度，而且关系干扰的排除等。测光方式分为透射式及反射式2.1扫描方式选择(1)直线扫描直线式扫描是用一光带先照射在薄层板的一端，而后作直线运动至另—端。在作直线式扫描时，实际上是光带固定，薄层板相对于光带作直线运动。在作直线扫描时，光带的长度对扫描后所得的色诺峰峰面积影响很大，下图说明了光带越长，所得的色谱蜂面积越小，反之则峰面积越大。光带太长，检测灵敏度低，光带太短，光带只通过斑点的一部分，所得的蜂面积，不能真实反砍斑点的吸收情况。因此，正常扫描时，应使光带长度略大于斑点直径。在多斑点扫描的，光带长度略大于最大斑点直径。为了降低定量误差，应使标准品斑点的直径与检品斑点的直径尽量接近。样品斑点为带状时，光带长度应约为样带的2/3。不规则斑点，用直线式扫描定量，即使光带长度适宜，定量误差仍然较大，因为所得峰面积还与扫描方向有关。综上所述，直线式扫描较适用于规则圆形薄层色谱斑点及条状薄层色谱斑点的定量分析。所能测定斑点的大小，以仪器的光带长度为上限。例CS—930薄层扫描仪，出射狭缝最大长度(高度)为6mm，只能测定小于6mm的斑点。在作直线式扫描叫，光带的步进距离ΔY也影响蜂面积。斑点小应选小步进距离，选择适宜，能降低定量误差。有关TLC及HPTLC板的光带长度及步进距离的具体选择见表。(2)锯齿式扫描用截面积为正方形的光束照射薄层板，光束的运动轨迹为矩齿形。CS系列的摆动距阂最大为30mm，因此锯齿式扫描适用于直径小于30mm的斑点。直线式扫在做锯齿形扫描时，由于光束来回通过斑点，吸光度积分值比描大，重复性较好。锯齿扫描还适用于不规则斑点的定量。虽然扫描方向不同时，所得的色谱峰形状有差别，但积分值差别较小。机械锯齿式描仪器扫描速度慢是其缺点，飞点扫描型仪器(如CS－9000型薄层扫描仪)则克服了此缺点。2.2波长选择波长选择适宜不仅可以提高灵教度，在双波长法印还可排除干扰并可使基线平直，因而波长选择关系重大。单波长与双波长法的波长选择分述如下。(1)单波长薄层扫描法用一种波长的单色光进行薄层扫描的方法称为单波长薄层扫描法，简称单波长法。用单波长法所得的薄层色诺扫描图是A－Rf或A－L曲线。通常选λmax为测量波长，以增加检测灵敏度。单波长法较适用于分离度较好，无背景干扰的薄层色谱的扫描，否则基线波动较大(2)双波长薄层扫描法用两种波长的单色光交替照射薄层板，测定斑点对两种波长的单色光的吸光度之差称双波长薄层扫描法，简称双波长法。所得的薄层色谱扫描图是ΔA－Rf或ΔA－L曲线。(3)双校长法的优点a.可以排除分离度不佳的两个斑点间的相互干扰，能用于分离度不佳以至于完全重叠斑点的定量分析。b.可以排除背景污染的干扰，使基线平直。c.可以提高灵敏度。d.可以改变色谱峰的倒正。这些优点的实现，主要取决于波长对的选择。3·定量分析方法TLCS最常用的定量方法是外标法，包括外标一点法和外标二点法。1外标一点法标准曲线通过原点（截距为零）时可用外标一点法定量。即只需一种浓度的对照品溶液，与供试液同板展开，分别测定其峰面积A,即C待=A标C标/A待2外标二点法该法是TLCS法中主要的定量分析方法。标准曲线不通过或一种浓度原点时只能用该法定量，至少需点两种不同浓度两种点样量的对照品溶液，与供试液同板展开，分别测定其峰面积A，用对照品求直线方程：A=Km+B,代入即得。例1山楂化滞丸中熊果酸的含量测定测定法：取重量差异项的本品3g，剪碎，精密称定，加水10ml，放置使溶散，滤过，药渣再用水10ml洗涤，在室温干燥至松软的粉末状，在100℃烘干，连同滤纸一并至索氏提取器内，加乙醚适量，加热回流提取4h，提取液回收乙醚至干，残渣用石油醚（30~60℃）浸泡2次，每次5ml（浸泡2min），倾去石油醚，残渣加适量无水乙醇-三氯甲烷（3：2）混合溶液，微热使溶解，定量转移至5ml容量瓶内，并稀释至刻度，摇匀，作为供试液。另取熊果酸对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液。作为对照溶液，精密吸取供试液6ul及对照品溶液4ul与8ul，分别交叉点于同一硅胶G板上，以环己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（20:5:8:0.1）展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在110℃加热5~7min，至斑点显色清晰，取出，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定，进行薄层扫描，波长λs=535nm,λR=650nm,分别测量供试品与对照品A，计算即得.本品每丸含山楂以熊果酸（C30H48O3）计例1山楂化滞丸中熊果酸的含量测定1、+H2O10ml溶解，滤过+H2O10ml洗涤，干燥至松软粉末状100℃烘干索氏提取法+乙醚适量加热回流4h残渣石油醚（30~60℃）浸泡2次，5ml/次残渣+适量无水乙醇-三氯甲烷（3：2）混合溶液溶解，转移定容至5ml供试液2、另取熊果酸对照品适量，精称+无水乙醇制成0.5mg/ml溶液对照品溶液3、精吸供试液6ul及对照品溶液4ul与8ul，分别交叉点于同一硅胶G板上，以环己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（20:5:8:0.1）展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在110℃加热5~7min，至斑点显色清晰，取出，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定，进行薄层扫描，波长波长λs=535nm,λR=650nm,分别测量供试品与对照品A，计算即得.本品每丸含山楂以熊果酸（C30H48O3）计取本品3g,剪碎，精称分析：本题采取双波长扫描法,用外标二点法进行定量计算。得到△A与浓度C的线性关系代入即得。熊果酸高含量为有光泽的棱柱状(无水乙醇)或细毛样针状结晶(稀乙醇)，低含量为棕黄色或黄绿色粉末，具特殊的气味，是存在于天然植物中的一种五环三萜类化合物。熔点283～288℃.比旋光度[α]D25+67.5°（C=1，1mol/L氢氧化钾醇溶液中）。在15℃时，乙醇（99%）1毫升可溶解10毫克，沸腾1毫升可溶解45毫克。尚易溶于甲醇，丙酮，吡啶，不溶于水和石油醚例2香连丸中盐酸小檗碱的含量测定测定法：取本品适量，研细，取约0.2g，精密称定，置索氏提取器中，加盐酸-甲醇（1：100）的混合液适量，加热回流提取至提取液无色，将提取液移至100ml量瓶中，用少量上述混合液洗涤容器，洗液并入同一量瓶中，加上述混合液至刻度，摇匀，精密量取10ml，置50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试液。另取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含20ug的溶液，作为对照品溶液。精密吸取供试液4ul、对照液2ul与6ul，分别交叉点于同一硅胶G板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-水（4：2：1：1：0.2）为展开剂，在另一槽中加等体积的浓氨试液，预饱和15min后，展开，展距约10cm，取出，晾干，进行荧光扫描，激发波长：λ=366nm，测供试品荧光强度与对照品荧光强度的积分值，计算即得。本品每1含黄连以盐酸小檗碱（C20H18ClNO4）计。例2香连丸中盐酸小檗碱的含量测定置索氏提取器+盐酸-甲醇（1：100）的混合液加热回流至提取液无色转移至100ml量瓶用混合液洗涤容器并入量瓶，至刻度精取10ml与50ml量瓶+甲醇至刻度供试液2、另取盐酸小檗碱对照品适量，精称+甲醇制成20ug/ml溶液对照品溶液3、精密吸取供试液4ul、对照液2ul与6ul，分别交叉点于同一硅胶G板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-水（4：2：1：1：0.2）为展开剂，在另一槽中加等体积的浓氨试液，预饱和15min后，展开，展距约10cm，取出，晾干，进行荧光扫描，激发波长：λ=366nm，测供试品荧光强度与对照品荧光强度的积分值，计算即得。本品每1含黄连以盐酸小檗碱（C20H18ClNO4）计。1、取研细本品约0.2g,精称分析：