3730测序流程

3730XL测序基本流程汪大海深圳华大基因研究院散样组•准备模板：质粒、PCR产物•电泳鉴定DNA浓度和质量•测序PCR反应•纯化测序产物（上机前纯化）•上机•分析数据测序基本流程：一质粒DNA的提取碱裂解法基本原理：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，通过离心可沉淀下来碱裂法提取质粒操作步骤菌体的培养（挑单克隆或加少量菌液在含抗生素的培养基中，37℃震荡过夜培养菌体的收集（13000rpm离心1min，使菌体充分沉淀，弃上清）•溶液I的组分：1.0MTris-HCl/0.5MEDTA，pH8.0，用前按比例加入RNase酶•溶液I的作用：菌体悬浮•EDTA是在溶液I中主要起抑制DNase的作用。•如果缺了溶液I，我们也可以用等体积的水或LB培养基来悬浮菌体。•特别注意：菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。质粒提取步骤一：加入200ulI液，充分振荡,直到管底无沉菌为止RNase酶未加或失活•溶液II的组分：0.4NNaOH/2%SDS；两种溶液等体积混合后使用，必须现用现配•溶液II的作用：裂解作用•溶液II在天气冷时会产生絮状沉淀，可温水预热至沉淀消除。•SDS是离子型表面活性剂。它主要作用是：a.溶解细胞膜上的脂质与蛋白，从而破坏细胞膜。b.解聚细胞中的核蛋白。c.能使蛋白质变性而沉淀下来。质粒提取步骤二：加入300ulII液，轻柔颠倒5~10次。•这一步要注意两点：第一，时间不能过长，尽量不要超过5min。因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。超螺旋结构复制中间体开环•溶液III的组分：3M乙酸钾，冰乙酸调PH值至4.8～5.2。•溶液III的作用:中和作用•3mol/LpH4.8~5.2的乙酸钾溶液是为了把抽提液的pH调至中性，从而使变性的质粒DNA复性，且稳定存在。•溶液III加入后的沉淀实际上是K+置换了SDS中的Na+形成了不溶性的PDS(十二烷基硫酸钾potassiumdodecylsulfate)质粒提取步骤三：每孔加入300ul4℃预冷的III液，立即上下翻转15~20次13000rpm4℃离心10min，沉淀蛋白弃上清，加入600ul预冷的70%乙醇，13000rpm离心5min转移600ul上清至滤膜上，13000rpm离心1min，尽量不要吸入蛋白放置冰上10min加入600ul异丙醇，上下翻转10~15次，13000rpm20℃离心20min弃上清，放通风处晾置20～30分钟加30～40ulmillipore纯水，室温放置3～5min，电泳鉴定ＲＮase质粒加样孔溴芬兰带二电泳鉴定目的：检测质粒抽提的质量好图对DNA的纯度要求尽量去净：残留的盐分和SDS蛋白质残留的RNA•RNA1ug•PEG0.3%•NaAc0.5mM•Ethanol1.25%•Phenol/CHCl30%•CsCl5mM测序可以容忍的杂质浓度杂质上限三测序的PCR反应测序反应DNA1LBigDye4L引物(3.2pmol/l)1L去离子灭菌水4L总体积10L测序PCR循环条件96C1min(96C10sec50C5sec60C4min)x25个循环4C保温ABIBigDye3.1的组成成分•测序酶•脱氧的dNTP•双脱氧的dNTP(荧光标记)•Mg2+•ddH2O•buffterDNA测序模板用量PCR产物100-200bp1-3ng200-500bp3-10ng500-1000bp5-20ng1000-2000bp10-40ng2000bp20-50ng质粒150-300ng大分子量模板(Cosmid、BAC)0.5-1g细菌基因组DNA2-3g引物与模板的平衡最关键质粒200ng:3.2pmolPCR产物100-200bp1-3ng:3.2pmol200-500bp3-10ng:3.2pmol500-1000bp5-20ng:3.2pmol为什么要定量浓度太低：会导致反应不充分，测序信号较弱。浓度太高：1.会导致小片段进样过多，信号迅速衰减（见下图）。2.DNA中包含较多杂质，会对后续测序反应产生影响。PCR与测序反应的比较PCR测序反应DNA聚合酶Taq酶测序酶引物一对单向底物dNTPdNTP+ddNTP*质量要求量少高产物等长的DNA片段长短不一的片段荧光标记无3’端带荧光标记四测序产物纯化（上机前纯化）•目的：去除未结合的荧光染料终止物去除残余的引物、盐离子、酶等电进样对DNA纯度的要求•毛细管和电极置于样品溶液中，加电压后，荷负电的DNA进入毛细管，向正极泳动。信号强度(进样量)取决于DNA片段的荷电量、片段大小及与杂质的竞争。•分子越小，上样越快•盐离子、RNA、蛋白质等与DNA片段竞争举例酒精/EDTA/NaAc法每管加入1L125mMEDTA，1L3MNaAc，到管底；每管加入25L无水乙醇，用胶垫封严密，震荡2－3min，室温放置15min；4300rpm离心30min，立即倒置384孔板离心，至300rpm停止，去除酒精；每管加入35L70%酒精，4300rpm4C离心15min，立即倒置384孔板离心，至300rpm停止，去除酒精；重复70%酒精洗涤1次；让残余的酒精在室温挥发干，加入10LHi-Di甲酰胺，95C变性4min，迅速冰冷4min，上样电泳。ABI3730xl自动测序仪外观图五上机操作阳极缓冲液瓶POP7胶瓶CCD检测窗口胶泵缓冲液槽水槽废液槽96个样品自动进样及一体化16板自动进样样品架待上机样品放这已跑完板子放这六测序结果的分析处理3730xlSequenceMap测序结果峰图文件Thanks!