【CN109806390A】一种SamRNA疫苗及其制备方法【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(43)申请公布日(21)申请号201910010764.1(22)申请日2019.01.07(71)申请人康希诺生物股份公司地址300457天津市滨海新区经济技术开发区西区南大街185号西区生物医药园四层401-420(72)发明人朱涛　李军强　巢守柏　莘春林　苗伟　路希山　(74)专利代理机构北京领科知识产权代理事务所(特殊普通合伙)11690代理人张丹(51)Int.Cl.A61K39/245(2006.01)A61P31/22(2006.01)C12N15/861(2006.01)(54)发明名称一种SamRNA疫苗及其制备方法(57)摘要本发明公开了一种SamRNA疫苗，所述的疫苗包括重组病毒载体，所述的重组病毒载体包括：i)病毒基因复制复合体，所述的病毒基因复制复合体包括编码病毒基因复制相关蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4的核苷酸序列，和ii)编码至少一种抗原的核苷酸序列。本发明所述SamRNA疫苗除了修饰化腺病毒载体本身的启动子可以转录抗原基因形成mRNA之外，所述的nsP1-4病毒基因复制相关蛋白以RNA为模板，大量合成mRNA，极大的提高目标抗原的免疫效果。权利要求书2页说明书9页序列表13页附图5页CN109806390A2019.05.28CN109806390A1.一种SamRNA疫苗，所述的疫苗包括重组病毒载体，所述的重组病毒载体包括：i)病毒基因复制复合体，所述的病毒基因复制复合体包括编码病毒基因复制相关蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4的核苷酸序列，和ii)编码至少一种抗原的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的SamRNA疫苗，其特征在于，所述的重组病毒载体为重组腺病毒、黑猩猩型腺病毒、重组水疱性口炎病毒、重组痘病毒、重组登革热病毒、重组昆津病毒、重组仙台病毒或重组犬瘟热病毒。3.根据权利要求1所述的SamRNA疫苗，其特征在于，所述的抗原引起针对细菌、病毒、真菌或寄生虫的免疫应答。4.根据权利要求3所述的SamRNA疫苗，其特征在于，所述的抗原为人带状疱疹病毒gE蛋白、轮状病毒VP4或VP7、HPV-L1蛋白或埃博拉病毒的gP蛋白。5.根据权利要求1所述的SamRNA疫苗，其特征在于，所述的抗原为肿瘤特异抗原，选自NY-ESO-1、SSX2、SCP1、RAGE、BAGE、GAGE、MAGE家族多肽、p53、p21/Ras、CDK4、MUM1、caspase-8、CIA0205、HLA-A2-R1701、β-联蛋白、TCR、BCR-abl、磷酸甘油醛异构酶、KIA0205、CDC-27、LDLR-FUT、Galectin 4、Galectin 9、蛋白酶3、WT1、碳酸酐酶、醛缩酶A、PRAME、HER-2/neu、乳腺珠蛋白、甲胎蛋白、KSA、胃泌素、端粒酶催化蛋白、MUC-1、G-250、p53、癌胚抗原、黑素瘤-黑素细胞分化抗原、PAP、PSA、PSMA、PSH-P1、PSM-P1、PSM-P2、p15、Hom/Mel-40、H-Ras、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EB病毒抗原、EBNA、人乳头瘤病毒抗原、乙型和丙型肝炎病毒抗原、人类嗜T淋巴细胞病毒抗原、TSP-180、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、mn-23H1、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、p16、TAGE、PSCA、CT7、43-9F、5T4、791Tgp72、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3(CA 27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TAAL6、TAG72、TLP、TPS。6.根据权利要求1所述的SamRNA疫苗，其特征在于，所述的重组病毒载体由修饰化腺病毒骨架质粒与含有编码至少一种抗原的核苷酸序列的穿梭质粒共转染得到，所述修饰化腺病毒骨架质粒上包括病毒基因复制复合体，所述病毒基因复制复合体为编码病毒基因复制相关蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4的基因序列。7.根据权利要求6所述的SamRNA疫苗，其特征在于，所述腺病毒骨架质粒选自：pAdEasy-1、pAdEasy-2、pBHG11、pBHG-fiber5或pBHG-fiber35。8.根据权利要求1所述的SamRNA疫苗，其特征在于，所述的重组病毒载体还包括：iii)转录抗原基因的启动子。9.根据权利要求1所述的SamRNA疫苗，其特征在于，所述的重组病毒载体还包括：iv)编码至少一种佐剂的核苷酸序列。10.根据权利要求8所述的SamRNA疫苗，其特征在于，所述的佐剂选自C3b、GM-CSF、IL-17、IFN、IL-15、IL-21、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、INF-α、INF-γ、CpG。11.一种权利要求1所述的SamRNA疫苗的制备方法，包括：修饰化腺病毒骨架质粒的构建；抗原基因片段的克隆；穿梭质粒的构建；穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染与包装，所述修饰化腺病毒骨架质粒上包括病毒基因复制复合体，所述病毒基因复制复合体为编码病毒基因复制相关蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4的基因序列。权　利　要　求　书1/2页2CN109806390A212.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-10任一所述的SamRNA疫苗和药学上可接受的辅料。13.权利要求1-10任一所述的SamRNA疫苗或权利要求12所述的药物组合物在制备用于哺乳动物的疫苗中的应用。14.一种修饰化腺病毒骨架质粒，其特征在于，所述腺病毒骨架质粒上包括病毒基因复制复合体，所述病毒基因复制复合体为编码病毒基因复制相关蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4的基因序列，所述腺病毒骨架质粒选自：pAdEasy-1、pAdEasy-2、pBHG11、pBHG-fiber5或pBHG-fiber35。权　利　要　求　书2/2页3CN109806390A3一种SamRNA疫苗及其制备方法技术领域[0001]本发明属于疫苗技术领域，具体涉及修饰化腺病毒载体生产mRNA疫苗的工艺技术及其制备方法，而且该腺病毒载体所生产的mRNA疫苗，可以RNA为模板进行持续的扩增形成更多的mRNA，简称samRNA(self-amplifying mRNA)。背景技术[0002]mRNA疫苗是具有免疫性、安全性、灵活性的基因疫苗，mRNA疫苗能够刺激免疫系统产生平衡、长效的保护。部分mRNA疫苗本身具有疫苗佐剂特性，通过产生多种细胞因子等不同方式刺激免疫系统，增强免疫机体反应能力，缩短免疫应答时间，加大抗体合成释放能力。[0003]1990年，科学家将体外转录的信使RNA(mRNA)注射入小鼠体内，通过检测发现其可在小鼠体内表达活性，产生相关蛋白且具有剂量依赖性。这种直接注射mRNA的方法能够通过表达特定蛋白，产生免疫反应，这就是mRNA疗法的雏形。[0004]相比传统疫苗，mRNA的安全性更有优势，不会插入基因突变，可以被正常细胞降解，通过调节序列修饰和递送载体可以改变其半衰期等。更重要的是，传统疫苗对很多新型病毒有心无力，更别提像癌症这种严重威胁人类健康的疾病了。而mRNA的作用机理使它就像一本餐谱一样，只要编好RNA序列，就可以将细胞变成小型的药物工厂，mRNA引导细胞自己产生特定蛋白发挥系统药效。[0005]mRNA疫苗作用机理：mRNA参与DNA转录和蛋白质生成的中间步骤。目前用于制造疫苗的有两种RNA，非复制型(non-replicating)mRNA和自我扩增型(self-amplifying)mRNA(SamRNA)。传统mRNA疫苗编码的抗原包含5′和3′的未翻译区(UTRs)，而自我扩增型RNA不仅能编码抗原，还有类似病毒复制过程的序列，使其可以在细胞内复制，提高蛋白表达量。[0006]mRNA可以通过体外cDNA模板转录而成，转录后期在mRNA增加蛋白质编码的开放阅读框(open reading frame，ORF)，使合成的mRNA具有编码蛋白质的功能。开放阅读框至少由两个重要元素组成：5’端的“帽子”结构和一条多聚A(poly A)的“尾巴”。此外，增加不转录区域(untranslated regions，UTRs)及其他复合物协助mRNA的稳定转录。[0007]但是，裸露的mRNA直接进入体内会被降解，而高效的mRNA递送是疫苗药效的保证，因此开发高效的mRNA递送载体是确保疫苗有效的关键因素。目前mRNA的给药方式多以皮内或者节内注射为主，但是这种注射方式由于体内mRNA的降解，因此需要大量给药才能激发机体产生有效的免疫应答。有文献报道可以用鱼精蛋白，以及其他的高分子，比如脂质体来包裹mRNA，从而避免机体内蛋白酶对mRNA的大量破坏。虽然这种包裹方式相比较直接注射可以有效增加机体对抗原的吸收量，但是仍然存在一些缺陷需要克服，比如有效的包裹量，包裹后的mRNA在体内的释放时间，以及mRNA在体内的释放和转移等。[0008]目前，腺病毒(adenovirus，Ad)载体系统已经大量的被应用于基因治疗药物以及疫苗的开发，临床中也有腺病毒载体系统的大量报道，其安全性和作为基因递送载体的可靠性已经充分证实。根据其能否复制，将腺病毒载体分为复制型和复制缺陷型。目前复制缺说　明　书1/9页4CN109806390A4陷型腺病毒载体更为常用，与复制型腺病毒载体相比，前者的安全性更好，载体自身的免疫原性更低。腺病毒载体疫苗是指以腺病毒作为载体，将保护性抗原基因重组到病毒基因组中，腺病毒载体中的抗原基因有病毒衣壳蛋白保护，可以避免宿主体内各种蛋白酶对携带基因的降解，有效解决了mRNA从注射部位到宿主细胞被降解风险，腺病毒载体在感染宿主细胞后，所携带的抗原基因或者目标基因就可以表达蛋白。[0009]mRNA疫苗除了易于降解、生物利用度低之外，还有一个问题就是拷贝数。无论是直接注射，还是常用的鱼精蛋白包裹的mRNA，都是一个mRNA只能在生物体内有效的翻译一次，这极大的限制了mRNA作为疫苗的利用度。因此，为解决此现象，需要设计一个可复制的系统，保证在宿主细胞内能不断的产生mRNA。该腺病毒载体感染宿主细胞后，将携带基因注入宿主细胞，这些基因可以利用宿主细胞的各碱基对合成mRNA。更为关键的是腺病毒为DNA病毒，DNA病毒在宿主体内的基因扩增能力远高于RNA病毒。因此以腺病毒作为载体将极大提高mRNA的拷贝数。[0010]腺病毒载体疫苗感染宿主细胞后，目的基因的拷贝数通过腺病毒载体本身的启动子强弱来决定，尤其对复制缺陷型腺病毒载体而言，其复制功能还是比较弱。为了解决这个问题，在本发明中，发明人对腺病毒基因进行修饰，实现腺病毒载体本身的启动子与修饰基因共同作用，极大提高了目标抗原的表达率。也可以在携带mRNA基因的腺病毒载体中加入佐剂的DNA，如此构建的腺病毒载体系统不仅可以提高机体免疫原性，也可以产生佐剂的效果。发明内容[0011]本发明提供一种SamRNA疫苗，所述的疫苗包括重组病毒载体，所述的重组病毒载体包括：i)病毒基因复制复合体，所述的病毒基因复制复合体包括编码病毒基因复制相关蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4的核苷酸序列和ii)编码至少一种抗原的核苷酸序列。[0012]优选的，所述SamRNA疫苗还包括iii)转录抗原基因的启动子。[0013]优选的，所述的重组病毒载体为重组腺病毒、黑猩猩型腺病毒、重组水疱性口炎病毒、重组痘病毒、重组登革热病毒、重组昆津病毒、重组仙台病毒或重组犬瘟热病毒。更优选的，所述的重组病毒