蛋白浓度测定的方法

蛋白质含量测定的方法1、微量凯氏定氮法2、双缩脲法（Biuret）3、Folin-酚试剂法（Lowry）4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法（Bradford）6、BCA比色法1、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法原理：含氮有机物与浓硫酸共热分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸铵。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：H2NCH2COOH+3H2SO4®2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1)2NH3+H2SO4®(NH4)2SO4(2)(NH4)2SO4+2NaOH®2H2O+Na2SO4+2NH3(3)为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。灵敏度：低。0.2~1.0mg氮，误差为±2％时间：费时8～10小时说明：用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长干扰物质：非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）2、双缩脲法（Biuret法）原理：蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中，蛋白质与Cu2+形成紫色络合物，此紫色络合物颜色的深浅与蛋白质含量成正比，而与蛋白质的相对分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。多肽键＋碱性Cu2＋®紫色络合物灵敏度：低。1～20mg时间：中速，20~30分钟优点：较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。缺点：灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。干扰物质：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等说明：用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似3、Folin—酚试剂法（Lowry法）显色原理：与双缩脲方法相同，只是加入了第二种试剂，Folin—酚，以增加显色量提高灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色，在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的含量成正比。干扰物质：硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇；酚类、柠檬酸、糖类、甘油等。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸钠（1%），硝酸钠（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1～2倍。灵敏度：高，5mg。20～250mg。时间：慢速，40~60分钟优点：灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多。缺点：费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。说明：颜色深浅随不同蛋白质变化。也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。加Folin—酚试剂时要特别小心，该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。4、紫外吸收法原理：由于蛋白质分子中，酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度与蛋白质含量成正比，可用作定量测定。灵敏度：较高，50~100mg时间：5~10分钟干扰物质：各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，利用280nm进行紫外检测，来判断蛋白质吸附或洗脱情况是最常用的方法。缺点：准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。说明：用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正。由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。5、考马斯亮兰法（Bradford法）原理：1976年由Bradford根据蛋白质与染料相结合的原理设计。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595与蛋白质浓度成正比。灵敏度：最高。1～5mg时间：5~15分钟干扰物质：强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS；去污剂。优点：（1）灵敏度高。（2）快速、简便，只需加一种试剂。（3）干扰物质少。缺点：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定。（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。说明：最好的方法；干扰物质少；颜色稳定；颜色深浅随不同蛋白质变化6、BCA比色法原理：在碱性溶液中，蛋白质将Cu2+还愿为Cu+再与BCA试剂（4，4´-二羧酸-2，2´-二喹啉钠）生成紫色复合物，于562nm由最大吸收，其强度和蛋白质浓度成正比。灵敏度：10～1200ug/ml。优点：单一试剂、终产物稳定，于lowry法相比几乎没有干扰物质的影响。尤其是在TritonX-100，SDS等表面活性剂中也可以测定。说明：BCA试剂盒测定法，快速，简单。