大肠杆菌感受态细胞的制备和转化报告

实验九，十大肠杆菌感受态细胞的制备和转化分子生物学2008实验2010在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，称感受态细胞。一.实验原理1.概念感受态细胞分子生物学2008实验2010转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化分子生物学2008实验2010转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体,它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如物理制备法,化学制备法等)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenentcells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。转化转化过程分子生物学2008实验2010KCl法，CaCl2法，电击感受态制备等RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但制备较复杂，不适合实验室用电击感受态细胞转化效率高，操作简便，但需电击仪CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃以下保存半年，因此CaCl2法使用更为广泛.常用的感受态细胞制备方法分子生物学2008实验2010CaCl2法是以Mendel和Higa（1970）的发现，其基本原理是：细胞处于0～4℃，CaCl2低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃90秒热激处理，促进细胞吸收DNA混合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如卡那霉素耐药基因得到表达，然后将此细菌培养物涂在含卡那霉素的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。CaCl2法制备感受态细胞原理分子生物学2008实验2010提高转化效率的几个因素细胞生长状态和密度质粒的质量和浓度试剂的质量防止杂菌和杂DNA的污染分子生物学2008实验2010细胞生长状态和密度:不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。提高转化效率的几个因素分子生物学2008实验2010质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。提高转化效率的几个因素分子生物学2008实验2010试剂的质量:所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度的,并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。提高转化效率的几个因素分子生物学2008实验20101）材料E.coliDH5α菌株；质粒、1.5ml离心管（又称eppendorf管）卡那霉素；2）设备恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，超净工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度计，微量移液枪，eppendorf管等。二.材料，设备及试剂分子生物学2008实验20100.1mol/L的CaCl2LB液体培养基LB固体培养基Kana母液：卡那霉素(Kanamycin)母液：配成100mg/ml水溶液,-20℃保存备用3.试剂分子生物学2008实验2010三.操作步骤本实验以E.coliDH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与质粒共保温,实现转化。由于质粒带有卡那霉素抗性基因，可通过卡那霉素抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入质粒，则在含卡那霉素的培养基上不能生长。能在卡那霉素培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了质粒。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。分子生物学2008实验20101.受体菌的培养1)从LB平板上挑取新活化的E.coliDH5α单菌落,接种于3-5mlLB液体培养基中,37℃,180rpm振荡培养过夜；2)将该菌悬液以1:30-100的比例接种于100mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2－3小时至OD600在0.3-0.4左右;3)无菌条件下取1.5ml菌液到eppendorf管中，冰浴10min，4℃,8000rpm离心5min;4)彻底弃上清液，在冰浴上加入500ul预冷的无菌CaCl2(0.lmol/L)使细胞悬浮；分子生物学2008实验20105)4℃,8000rpm离心4min，弃上清液;6)用100μl预冷的无菌CaC12(0.lmol/L)重新悬浮细胞，冰上备用；分子生物学2008实验20102.转化①取50μl感受态细胞悬液，在冰浴中使其解冻，加入10μl连接产物（或质粒DNA）(含量不超过50ng,体积不超过10μl)，轻轻摇匀，冰上30-40min；A.质粒DNA组：10µl质粒DNA+50µl感受态细胞悬液B.空白对照组:10ul无菌水＋50µl感受态细胞悬液分子生物学2008实验2010②42℃水浴中热击90秒（勿摇动），热击后迅速置于冰上冷却2min；③向管中加入400μlLB液体培养基(不含卡那霉素)，混匀后37℃，180rpm振荡培养40min，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(卡那霉素)；④涂平板：将上述菌液摇匀后取80ul涂布于含Kana的筛选平板上，在菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养皿培养12~18h。分子生物学2008实验2010注意：1、含卡那霉素的LB固体培养基的配制:将灭菌的LB固体培养基水浴溶解后冷却至60℃左右,加入Kana储存液,使终浓度为50-100ug/ml,摇匀后到平板；2、1小时空间：转化后温浴45min左右，让抗性基因得以表达，再涂抗性平板分子生物学2008实验2010分子生物学2008实验20101.感受态细胞有何特点？如何保证它的质量？2.如阴性对照中长出菌，原因？3.还有哪些方法可以将外源基因导入受体细胞？各有什么优缺点？四.问题与讨论