菌种鉴定手段

菌种鉴定手段（1）常规鉴定常规鉴定内容有形态特征和生理生化特征。形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应等。（2）BIOLOG碳源自动分析鉴定BIOLOG鉴定系统以微生物对不同碳源的利用情况为基础，检测微生物的特征指纹图谱，建立与微生物种类相对应的数据库。通过软件将待测微生物与数据库参比，得出鉴定结果。该系统已获美国FDA认可，已逐步应用于食品和饮品企业、环保、海洋生物/水产品、制药、农业微生物、生物治理、化妆品、临床等领域的微生物鉴定试验中。BIOLOG是一种微生物菌种快速鉴定系统，涉及革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、厌氧菌、酵母、丝状真菌在内近2000种微生物。（3）分子生物学鉴定应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系，是目前微生物分类学研究普遍采用的鉴定方法。CICC拥有微生物菌种分类鉴定的分子生物学实验室，配有PCR仪、高速冷冻离心机、电泳仪、HPLC、凝胶成像系统、紫外控温分析系统等先进仪器设备，以及DNAMAN、BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析软件。目前CICC可采用核酸序列分析法分析细菌16SrDNA/16S-23SrDNA区间序列、酵母18SrDNA/26SrDNA（D1/D2）序列及丝状真菌的18SrDNA/ITS1-5.8S-ITS2序列，提供科学的鉴定结果。（4）API细菌数值鉴定系统API鉴定系统涵盖15个鉴定系列，约有1000种生化反应，目前已可鉴定超过600种的细菌。鉴定过程中，可根据细菌所属类群选择适当的生理生化鉴定系列，通过软件将待测细菌与数据库参比，得出鉴定结果。CICC目前可应用API50CH系列、API20E系列、APIStaph系列对乳酸杆菌（Lactobacillussp.）和相关细菌、芽孢杆菌（Bacillussp.）、葡萄球菌属（Staphylococcussp.）、微球菌属（Micrococcussp.）和库克菌属（Locuriasp.）进行鉴定。（5）功能性分析及功能基因CICC不断致力于工业微生物资源的功能及其功能基因研究，目前通过木聚糖酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、β-甘露聚糖酶等功能基因的克隆进行菌种产酶的功能性分析。应用gyrA、atpD及pheS等看家基因于微生物菌种鉴定，在某些种、亚种、株间有较好的分辨效果。（6）RAPD、SSCP技术随着微生物菌种应用的进一步发展，在食品安全管理、生物产品出口认证、知识产权保护等行业需求日益增加，微生物菌种株水平的鉴别技术成为一个迫切需要解决的问题。CICC采用随机扩增多态性DNA（RandomlyamplifiedpolymorphismDNA，RAPD）技术和单链构象多态性(SingleStrandConformationPolymorphism，SSCP）技术对微生物菌株进行鉴别。如采用RAPD技术能够对同一菌种原始菌株与诱变菌株进行鉴别，对诱变菌株知识产权保护具有重要意义；采用SSCP技术进行工业酒精酵母菌株的鉴别，此技术结合菌株发酵特性，在酒类生产的质量控制方面起到积极作用。（7）TLC薄层层析CICC将TLC薄层层析技术应用于微生物菌种鉴定，进行细菌、放线菌细胞壁化学组分分析（氨基酸、糖），作为划分属特征的重要鉴定技术手段，起到了良好的辅助作用。（8）全细胞脂肪酸分析鉴定系统采用Sherlock全自动细菌鉴定系统，通过对不同菌株的脂肪酸图谱进行分析，并与标准数据库进行比对，来鉴定细菌及酵母。该技术是细菌或酵母种水平鉴定的有效手段之一。（9）（G＋C）mol％及DNA/DNA杂交CICC通过采用DU800核酸蛋白分析仪测定Tm值，从而得到微生物菌株的（G＋C）mol％，并与模式菌株进行DNA/DNA同源性分析，该鉴定技术手段是多相鉴定的重要组成部分。（10）实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR仪是特异性靶基因检测与定量的一体化系统，其将PCR热循环、荧光检测和各种应用分析软件结合在一起，可以动态观察PCR每一循环各反应管中PCR扩增产物逐渐增加的情况。根据荧光强度确定PCR产物的定量法主要有荧光染料（SYBRGreenI）法和荧光探针（Taqmanprobes）法。与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度更高等特点。实时荧光定量PCR技术目前已得到广泛应用，包括基于相对定量分析的基因表达分析，以标准曲线为基础的菌株绝对定量分析，定性的PCR扩增后核酸序列的SNP基因型分析，以及以阳性内对照为基础的阳性/阴性结果判定等。（11）微生物菌群分析（DGGE）DGGE(denaturinggradientgelelectrophoresis)，即变性梯度凝胶电泳，是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。DGGE已广泛用于分析自然环境中细菌、蓝细菌、古菌、微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多样性。这一技术能够提供群落中优势种类信息并同时分析多个样品，具有可重复和操作简单等特点，适合于调查种群的时空变化，并且可通过对条带的序列分析或与特异性探针杂交分析鉴定群落组成。（12）微生物菌群分析（克隆文库构建）当微生物菌群中含有不可培养或难培养菌种，且其丰度较低时，要全面解析菌群结构及多样性，只采用传统的平板分离或PCR-DGGE分析难以达到理想结果，这时可以结合构建16SrDNA克隆文库的方法。细菌16SrDNA扩增产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，EB染色，在UV下显现，从胶上切取DNA条带，经纯化后，链接到pGEM®-TEasy载体，并转化入大肠杆菌（Escherichiacoli）。待长出白色菌落后，挑选白色菌落进行菌落PCR-DGGE（16SrDNAV3）辅助筛选，得到特定菌群中的所有克隆菌，再经质粒提取，基因测序后，便可得到特定微生物菌群信息。（13）细菌呼吸醌组分测定细菌细胞膜上的呼吸醌有甲基萘醌（menaquinone，MK）和泛醌（ubiquinone，辅酶Q）。对革兰氏阳性的放线菌而言，通常只含有甲基萘醌。常用来分析呼吸醌的方法有薄板层析法和高压液相色谱法等。醌分子中的多烯侧链长度及氢饱和度对于细菌具有重要的分类学意义。（14）细菌磷酸类脂分析磷酸类脂（phospholipioides）属极性脂（polarlipid），与蛋白质、糖等构成细胞膜，对于物质运输、代谢及维持正常的渗透压都有重要作用。不同属菌的磷酸类脂组分是不同的，它是鉴别属的重要特征之一，是化学分类项目中不可缺少的分类指征。磷脂种类很多，对于放线菌而言，具有分类学意义的磷酸类脂有5种：磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰甲基乙醇胺（phosphatidylmethylethanolamine，PME）、磷脂酰甘油（phosphatidyglycerol，PG）及GluNU（含葡萄糖胺未知结构的磷脂，phospholipidofunknownstructurecontainingglucosamine）。