DPPH法评价抗氧化活性研究进展

※专题论述食品科学2014,Vol.35,No.09317DPPH法评价抗氧化活性研究进展韦献雅1，殷丽琴1，钟成2，章明海1，牛应泽1,*（1.四川农业大学油菜研究中心，四川成都611130；2.四川农业大学玉米研究所，四川成都611130）摘 要：植物化合物或植物提取物的抗氧化活性的体外评价是研究功能因子的一个重要方面。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）法常用于评价化合物或植物提取物的抗氧化活性，但由于没有一个标准化的方法，因而不同实验的结果难于相互比较。本文从DPPH法的原理、测定方法、检测波长、DPPH初浓度、反应时间、清除率计算公式、结果表达、评价指标等几个方面对DPPH法做归纳总结，分析几种外界因素对DPPH法的影响，有助于研究者提高认识，从而准确的开展研究工作。关键词：DPPH法；自由基；抗氧化剂；抗氧化活性AdvancesintheDPPHRadicalScavengingAssayforAntioxidantActivityEvaluationWEIXian-ya1,YINLi-qin1,ZHONGCheng2,ZHANGMing-hai1,NIUYing-ze1,*(1.RapeseedResearchCenter,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China;2.MaizeResearchInstitute,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China)Abstract:invitroevaluationoftheantioxidantactivityofplantcompoundsorplantextractsisanimportantaspectoffunctionalfactorresearch.TheDPPH(1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)radicalscavengingassayiswidelyusedforantioxidantactivityevaluationofplantcompoundsandextracts.However,thismethodlacksastandardizedprogramsothatresultsfromdifferentexperimentsmaybedifficulttocomparewitheachother.Thepresentreviewpresentsacomprehensiveoverviewoftheprinciple,measurementprocedureandwavelength,initialDPPHfreeradicalconcentration,reactiontime,calculationofthescavengingrate,expressionofresultsandevaluationindices.SeveralexternalfactorsinfluencingtheDPPHassayarealsodiscussed.Keywords:DPPHmethod;freeradical;antioxidant;antioxidantactivity中图分类号：TS207.3文献标志码：A文章编号：1002-6630（2014）09-0317-06doi:10.7506/spkx1002-6630-201409062收稿日期：2013-06-25基金项目：四川省科技计划项目（12CGZHZX0712）；四川省教育厅重点科技项目（11LD018）作者简介：韦献雅（1980—），女，博士研究生，研究方向为作物遗传育种。E-mail：[e-mail]*通信作者：牛应泽（1955—），男，教授，博士，研究方向为作物遗传育种。E-mail：[e-mail]近年来自由基生物学快速发展，广泛触及生命科学领域，其主要探究自由基的组成、清除和自由基对生物学系统的损害。目前已明确一系列由自由基造成的疾病机理，如动脉粥样化、神经变性、慢性抑郁症、癌症和生理学衰老[1]。抗氧化剂具有清除自由基的作用，对人体健康有益，已广泛用于食品工业中。体外评价和筛选物质抗氧化活性的方法有很多，如1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazylradical2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）法、2,2’-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2,2’-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid）ammoniumsalt，ABTS）法、氧化自由基吸收能力（oxygenradicalabsorbancecapacity，ORAC）法、铁离子还原法（ferricreducingantioxidantpower，FRAP）法[2]等。与其他相比，DPPH法有稳定性好、灵敏度高、操作简单等优点[3-4]。DPPH法已在全世界范围内被广泛用于自由基清除能力的定量分析[2]。Blois[5]最先报道了DPPH法，发现DPPH自由基能被硫代半胱氨酸和其他活性物质清除。此后，Brand-Williams等[6]对DPPH法作了进一步修订，使之成为评价体外抗氧化活性的重要途径。然而到目前为止DPPH法并没有一个标准化的实验程序，尤其在反应时间、体积比、DPPH自由基初浓度、结果表达等方面，使得很难比较不同实验室、不同操作程序的结果[2,7-8]。本文主要从DPPH法的原理、测定方法、检测波长、DPPH自由基初浓度、反应时间、清除率计算公式、结果表达、评价指标等几个方面做归纳总结，并介绍几种外界因素对DPPH法的影响，以期为广大研究者提供一定的参考。3182014,Vol.35,No.09食品科学※专题论述1DPPH法原理DPPH自由基是一种人工合成的、稳定的有机自由基，分子式为C12H12N6O6（Mr=394.32），其结构中含有3个苯环，1个N原子上有一个孤对电子（图1）[9]。其甲醇或乙醇溶液呈深紫红色，并在515～520nm范围有最大吸收峰[5-6]。当向DPPH自由基溶液中加入自由基清除剂，孤对电子被配对，深紫色的DPPH自由基被还原成黄色DPPH-H非自由基形式，其褪色程度与所接受的电子数量成定量关系，因而可以通过吸光度的变化进行定量分析[10-11]。清除DPPH自由基是DPPH法的根据[12]。ON2N2ON2ONN图1DPPH自由基的化学结构Fig.1ChemicalstructureofDPPHfreeradical根据反应机制可将评价抗氧化能力的方法基本分为两种：基于H原子转移（H-atomtransfer，HAT）的反应和基于电子转移（electrontransfer，ET）的反应[13-14]。以酚类物质（ArOH）为例，其清除DPPH自由基的反应有两种机制：直接提供酚的氢离子给DPPH自由基（HAT反应），见式（1）；从酚（ArOH）或其酚阴离子（ArO·）转移电子到DPPH自由基（ET反应），见式（2）[15]。具体是哪一种途径取决于溶剂的特性和/或待测物质的氧化还原能力。一般在非极性溶液中HAT机制占优越性，但在极性溶液中，如乙醇、甲醇，DPPH自由基能和酚（ArOH）形成较强的氢键，从而ET机制占主要[16]，二者也可同时发生[14]。ArOH＋DPPH自由基→ArO·+DPPH·H（1）ArO·＋DPPH自由基→产物（2）2DPPH自由基清除率测定方法测定DPPH自由基清除率的方法很多，使用最早、最频繁的是分光光度计法[5-6]。另外，针对不同的实验目的和材料，人们利用高效液相色谱技术（highperformanceliquidchromatography，HPLC）[17-20]、电子顺磁共振技术（electronparamagnaneticresonance，EPR）[21-22]、薄层层析技术（thinlayerchromatography，TLC）[23-24]等开发了一些测定物质清除DPPH自由基活性的新型方法。2.1分光光度计法DPPH自由基在517nm波长附近有最大吸收峰，当DPPH自由基与抗氧化剂反应后，517nm波长处的吸收值降低，其降低的程度与接收的电子（抗氧化剂清除自由基活性）呈定量关系，反应进程很容易通过分光光度计监测[5-6,25]。由于该方法简单、灵敏、快速，因此使用最广泛。DPPH自由基清除计算公式一般为：DPPH㠚⭡ส␵䲔⦷/%=AˉAAh100（3）式中：A对照为未加样品的DPPH自由基吸光度；A样品为加入样品反应后的DPPH自由基吸光度。2.2HPLCHPLC法是基于DPPH自由基吸收峰（PAs）的减少，来检测待测物质的DPPH自由基清除活性。通过比较反应前后DPPH自由基吸收峰（PAs）的变化，可灵敏地区分DPPH自由基吸收值的微小变化[17]。另外，通过HPLC法比较反应前后待测物中各组分的吸收峰变化，可以判断哪种组分的DPPH自由基清除活性高[20]。DPPH-HPLC法及DPPH-HPLC-MS法已成功用于筛选和鉴定复杂混合物质中的抗氧化成分[20,26]。但是对于批量实验，该方法可能会耗费大量时间。DPPH自由基清除率计算公式为：㠚⭡ส␵䲔⦷/%=PAˉPAPAh100 （4）式中：PA空白为未加样品的DPPH自由基吸收峰面积；PA样品为加入样品反应后的DPPH自由基吸收峰面积。2.3EPREPR是直接检测和研究含有未成对电子的顺磁性物质的现代分析方法，具有简单、灵敏度高、样品不受破坏和无干扰等优点，是目前检测自由基最直接、有效的方法之一[22]。由于DPPH自由基是稳定的顺磁化合物，适合EPR检测。DPPH-EPR法直接测定自由基的浓度，显著提高了分析的准确性[21]。但由于成本较高，该方法使用并不常见。3DPPH法注意事项3.1检测波长同一物质在不同波长下的吸收程度不一样，检测波长的选择关系到吸光度的准确性，影响实验结果的准确性。DPPH自由基的甲醇或乙醇溶液最大吸收波长在500～520nm。统计大量文献后发现，使用频率最高的是515nm[16,27-29]和517nm[8,10,18,30-31]，二者受青睐程度相当。也有使用516nm[32]和518nm[23]的。若对波长要求特别严格，可用扫描型分光光度计扫描DPPH自由基醇溶液的吸收光谱，确定最大吸收波长。※专题论述食品科学2014,Vol.35,No.093193.2DPPH自由基初浓度的选择关于DPPH自由基初浓度报道有很多（表1），没有统一的规定。有些研究者使用的DPPH自由基初浓度很高，导致反应体系中DPPH自由基吸光度超出了分光光度法的准确范围[33-34]。根据比尔定律，分光光度计的灵敏度范围在0.221～0.698，相当于透光率在20%～60%[33]，对应的适宜DPPH自由基浓度应在25～70μmol/L附近[8]。然而有很多人使用的DPPH自由基溶液浓度远超出了分光光度计的范围，甚至达到了300μmol/L[23]和500μmol/L[35]。Scherer等[2]在实验中使用的DPPH溶液吸光度在2～3之间，超出了分光光度计的准确范围，因而其数据结果被人质疑[36]。因此DPPH自由基初浓度不应超出分光光度计的准确范围[36]。表1DPPH自由基溶液的初始浓度Table1InitialDPPHradicalconcentrationsfromliteratureDPPH自由基初始浓度/（μmol/L）25506070100184200300500参考文献[37][8,27][32,38-39][31][28,30][40][41][23][35]3.3反应时间表2DPPH法反应时间Table2Reactiontimef