HPLC实验

对羟基苯甲酸酯同系物的HPLC分离鉴定张培敏2014/10/26HPLC分析实验2一、实验目的二、HPLC简介三、HP-1100液相色谱仪配置四、基本分离原理五、基本检测原理六、实验内容七、思考题2014/10/26HPLC分析实验3一、实验目的通过实验，学习色谱分析的基本原理及仪器的基本使用方法，了解计算机联机处理分析数据的过程。了解并学会色谱定量方法，比较不同方法的优缺点。2014/10/26HPLC分析实验41.高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较高速：HPLC采用高压输液设备，流速大大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV—10-9g,荧光检测器—10-11g。二、HPLC简介2014/10/26HPLC分析实验52.HPLC与GC的比较分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。2014/10/26HPLC分析实验63.应用由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性、适于非挥发性和热不稳定组分的分析，因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析，大多是通过HPLC来完成的。右图是各种HPLC方法的应用范围及对象极性增加不溶于水溶于水非极性离子非离子极性吸附反向分配分配正向分配离子交换尺寸排阻凝胶渗透凝胶过滤分子量2014/10/26HPLC分析实验7HPLC仪器包括：高压输液装置（四元梯度高压泵）进样系统;分离系统;C8ODS色谱柱检测系统;（可变波长紫外检测器）此外还配有梯度淋洗、自动进样和数据处理装置。色谱工作站其工作过程如图所示。三、HP-1100液相色谱仪配置：2014/10/26HPLC分析实验81.高压输液系统1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔很约2µm，可防止颗粒物进行泵内。2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。3）高压泵：对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。输液泵种类：恒压型和恒流型。恒压泵(类似于风箱)可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变化而变化，现已较少使用。恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵(见下图。每分钟往复25~100次，因此脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻尼器)。2014/10/26HPLC分析实验92.进样系统与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些。即，HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些因素包括：进样系统、连接管道及检测器的死体积。进样装置包括两种。1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，如图。装入样品出口进样采样环泵入溶剂进色谱柱2014/10/26HPLC分析实验10液相色谱进样方式2014/10/26HPLC分析实验113.色谱柱1）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。柱长多为15~30cm，内径为4~5mm(尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱柱内径更大)；2）柱的填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的性质不同可分为：平衡密度法：即使溶剂密度和填充颗粒密度相近，此时颗粒沉降速度趋于0。常用的匀浆试剂有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等；非平衡密度法：当采用粘度较大的试剂，如CCl4，CH3OH,丙酮，二氧杂环已烷、THF等。填充方法：填充时，按上述方法制作匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中，然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要求填充速度快(防凝聚、沉降或结块)、且无空气进入(影响填充均匀性)。2014/10/26HPLC分析实验124.检测器液相色谱检测器包括紫外吸收、荧光发射、示差折光和安培检测器等。1）紫外检测器其检测原理和UV-Vis方法一样。只是，此时所采用的吸收池为微量吸收池，通常其光程为2-10mm,体积约为1~10µL。HPLC分析中，约有80%的物质可以在254nm或280nm处产生紫外吸收。因此该类检测器应用很广。在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长。石英窗接色谱柱UV光电倍增管废液2014/10/26HPLC分析实验13色谱过程：在有互不相溶的两相——流动相和固定相的体系中，当两相作相对运动时，第三组分（即溶质或吸附质）连续不断地在两相之间进行分配的过程。由于流动相、固定相以及溶质混合物性质的不同，在色谱过程中溶质混合物中的各组分表现出不同的色谱行为，从而使各组分彼此相互分离。四、基本分离原理2014/10/26HPLC分析实验14色谱分析法的实质：不同溶质分子因结构不同而与流动相及固定相的不同，从而引起在色谱柱内运行过程中作用机理的差异。经过柱内多次作用的叠加后在宏观上引起其在柱内停留时间（保留时间）的差异，形成事实上的分离。四、基本分离原理2014/10/26HPLC分析实验15反相键合相色谱1、固定相：用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶。利用硅胶表面的硅醇基(Si一OH)与有机成分可成键,即可得到各种性能的固定相。本实验分离柱：C18或C8柱表面接有C18或C8的烷烃2014/10/26HPLC分析实验162014/10/26HPLC分析实验17（2）反相色谱中流动相极性对分离的影响外加有机溶剂通常减小组分的保留值。其极性越小，保留值越小待测物极性：ABC2、流动相：对被分离组分具有选择性作用，调节流动相的极性、pH、离子强度等调节流动相的洗脱强度（调节容量因子k），以改进分离或调整出峰时间。本实验流动相：（1）水，甲醇组成的极性溶剂的混合溶剂，适合极性小的芳香族化合物2014/10/26HPLC分析实验18从色谱流出曲线上，可以得到许多重要信息：（l）根据色谱峰的个数，可以判断样品中所合组份的最少个数．（2）根据色谱峰的保留值(或位置），可以进行定性分析．(3)根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析．（4）色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据．（5）色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相)选择是否合适的依据．2014/10/26HPLC分析实验19液相色谱分析中，因分子中的共轭大π电子的能级跃迁在紫外区有明显吸收，可以利用紫外检测器进行检测。五、基本检测原理2014/10/26HPLC分析实验20用标准物比对法定性：特定组分在同色谱条件下有不变的保留值(时间、体积等)，可将之与已知纯物质的相应保留值作比对的方法进行定性分析。定性定量分析的原理2014/10/26HPLC分析实验21用外标法定量：以不同量标准样品进样得到峰面积，然后作图得标准曲线，求出回归方程，得到相关系数。然后进样得到被测试样的峰面积从曲线中查到含量。方法适用于样品复杂，但只对部分组分感兴趣时。定性定量分析的原理2014/10/26HPLC分析实验22校正归一化法定量：因不同组分的紫外吸收情况不同，等量样品的吸光度值不相等。因而需要采用校正归一化法定量:方法适用于样品不很复杂，且部分组分都能流出色谱柱并在检测器上有响应时。定性定量分析的原理100%iiiiifAPfA=×∑isisiWAfWA=2014/10/26HPLC分析实验23注射器气相色谱注射器的针头为尖，液相色谱的注射器针头为平，两者不能混用。2014/10/26HPLC分析实验24实验步骤——I打开计算机启动“bootp”文件，然后打开仪器电源建立计算机和仪器的连接。启动工作站，调整好流动相流量和检测波长，等待基线平直。前期准备六、实验内容2014/10/26HPLC分析实验25实验步骤——II在甲醇:水=90:10、80:20、70:30的不同配比流动相中分别取混合标准溶液(对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯)10μL进样分析，记录保留时间和各组分间的分离度，以分离度大于1.5且保留时间最短为原则选定最佳流动相配比。注意：每次更换流动相都需等待5min左右以平衡色谱系统(信号线和压力线都平衡)。条件试验I—流动相配比2014/10/26HPLC分析实验26实验步骤——III在最佳流动相配比条件下，以0.8、1.0、1.5mL/min不同的流动相流速下取混合标准溶液(对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯)10μL进样分析，以同样原则选定最佳流动相流速。问题I：每次更换流动相还需等待5min吗？问题II：可以利用本步骤实验数据进行定量校正因子的确认吗？条件试验II—流动相流速2014/10/26HPLC分析实验27实验步骤——IV在最佳实验条件下，分别取对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯各10μL进样，记录各色谱峰保留时间，与步骤III所得结果相比较，进行定性分析。定性分析2014/10/26HPLC分析实验28实验步骤——V在最佳实验条件下，取2、5、8、10、15、20μL混合标样进样，以峰面积对进样量作标准曲线。要求该曲线的相关系数大于0.99，如果不满足则可对明显偏离的实验点进行重测。标准曲线制作2014/10/26HPLC分析实验29实验步骤——VI取10μL未知试样进样分析（重复3次），外标法定量。未知试样测定结束：用100%甲醇冲洗分离柱10分钟，依次关闭工作站和仪器电源2014/10/26HPLC分析实验30七、思考题根据实验数据，探讨气相色谱和液相色谱法中定量分析方法不同的原因。探讨高效液相色谱分析法的应用价值。所用的检测器是否适用于检测所有的有机化合物？为什么？若实验获得的色谱峰面积太小，应如何改善实验条件？为什么液相色谱多在室温下进行分离检测而气相色谱法相对要在较高的柱温下操作？