第十八章-平面色谱法-分析化学

仪器分析dxie1第十八章经典液相色谱法第十八章平面色谱法仪器分析dxie2第十八章经典液相色谱法一、平面色谱法的分类薄层色谱法(TLC)：光洁的玻璃板；纸色谱法：滤纸；薄层电泳法：惰性支持介质；薄膜色谱法：高分子薄膜。仪器分析dxie3第十八章经典液相色谱法二、薄层色谱参数1、定性参数0fllRRf值的最佳范围：0.3～0.5Rf值的可用范围：0.2～0.8比移值（Rf)仪器分析dxie4第十八章经典液相色谱法保持Rf值恒定真实的条件：展开室密闭且被展开剂饱和，无边缘效应；沿分离轨迹，固定相与流动相均无梯度变化；展开剂的前沿位置能正确测定。仪器分析dxie5第十八章经典液相色谱法相对比移值saSfafrllRRR参考物：加入样品中的纯物质或样品中的某一已知组分。Rr值可以小于１，也可以大于１。仪器分析dxie6第十八章经典液相色谱法2、相平衡参数分配系数与比移值的关系fRlluuRuRu000容量因子kRVKVVCVCWWkfmSmmSSmS11mSVVKR11SmmmSfKVVVVKVR11仪器分析dxie7第十八章经典液相色谱法影响比移值的因素被分离物质的结构和性质薄层板的性质，固定相的粒度，薄层的厚度，吸附剂的活度温度（主要对分配层析）展开室内的展开剂蒸气饱和程度仪器分析dxie8第十八章经典液相色谱法3、分离参数分离度211f2f021WWRRl2RWWd2RW1W2ddW1W2仪器分析dxie9第十八章经典液相色谱法分离数在相邻斑点的分离度为1.177时，在Rf=0和Rf=1两组分色谱斑点间能容纳的色谱斑点数。1bblSN100b0、bl为Rf=0和Rf=1的组分色谱斑点的半峰宽。仪器分析dxie10第十八章经典液相色谱法第二节薄层色谱法将固定相均匀地涂铺在具有光洁表面的玻璃、塑料或金属板上形成薄层，在此薄层上进行色谱分离的方法仪器分析dxie11第十八章经典液相色谱法一、薄层色谱法的主要类型1、吸附薄层色谱法当展开剂不断展开，各组分在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附、解吸，从而产生差速迁移得到分离。仪器分析dxie12第十八章经典液相色谱法2、分配薄层色谱法样品中各组分在固定相与流动相之间的分配系数不同而实现分离。正相分配色谱：展开剂的极性小于固定相的极性。固定相为水；展开剂为有机溶剂。反相分配色谱：展开剂的极性大于固定相的极性。固定相为烷基化学键合相，展开剂为水、醇等或它们的混合物。仪器分析dxie13第十八章经典液相色谱法3、胶束薄层色谱法以表面活性剂胶束溶液（胶体分散体系）为展开剂的薄层色谱法。被分离组分在水、胶束和固定相三者之间形成分配平衡(包括分配、静电作用和空间效应)固定相：一般为聚酰胺液动相：表面活性剂的水溶液（十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴铵等）正相胶束：亲水基团向外反相胶束：疏水基团向外仪器分析dxie14第十八章经典液相色谱法二、吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂1、吸附剂：是多孔性微粒状物质，具有较大的比表面积，在其表面有许多吸附中心。常用的吸附剂为硅胶、氧化铝、聚酰胺。仪器分析dxie15第十八章经典液相色谱法1、硅胶：具有硅氧交联结构、表面有许多硅醇基的多孔微粒。硅醇基是使硅胶具有吸附力的活性基团，由于其能与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而具有吸附性。粒度10～40μm；比表面积500㎡/g；比孔体积0.4ml/g；平均孔径为100nm；硅醇基密度8μmol/㎡仪器分析dxie16第十八章经典液相色谱法类型：硅胶H、硅胶G、硅胶HF254、硅胶GF254、硅胶GF254+366氧化铝H、氧化铝G、氧化HF254颗粒大小对展开速度和分离效果的影响：颗粒大，总表面积小，吸附量低，展开速度快，展开后斑点较宽，分离效果差；颗粒小，分离效果好，但展开速度慢。粒度要窄。干法：150～200目；湿法：250～300目；聚酰胺：100～180目。仪器分析dxie17第十八章经典液相色谱法SiOHHSiOSiOHOHSiO活泼型游离羟基束缚型吸附力减弱硅醇基的三种形式仪器分析dxie18第十八章经典液相色谱法活化：将硅胶加热至100℃左右，则其所含水除去，使硅胶活性增加。一般在105℃～110℃加热30分钟。但加热温度不可太高，否则易使硅胶失活：SiOHHSiO+OSiSi+H2O5000C硅胶具有微酸性，适用于分离酸性和中性物质，如有机酸、氨基酸、甾体等仪器分析dxie19第十八章经典液相色谱法2、氧化铝碱性氧化铝：生物碱、中性化合物。酸性氧化铝：酸性色素、氨基酸。中性氧化铝：生物碱、挥发油、萜类、甾体、甙类、酯、内酯等。氧化铝的活性与含水量密切相关，处理方法与硅胶相同。仪器分析dxie20第十八章经典液相色谱法3、聚酰胺白色多孔的非晶型粉末，不溶于水和一般有机溶剂，易溶于浓矿酸、酚、甲酸。吸附机制：聚酰胺分子内存在着很多酰胺基，可与酚、酸、硝基化合物、醌类等形成氢键。CH2CH2CH2CH2CH2NH..On仪器分析dxie21第十八章经典液相色谱法二、吸附剂和流动相的选择被测物质的结构、极性与吸附力饱和碳氢化合物不被吸附剂吸附；对于基本母核相同的化合物，其分子极性越强，吸附能力越强；分子中双键越多，吸附能力越强；分子中取代基的空间排列有利于形成氢键，吸附能力越强。烷烃烯烃醚硝基化合物二甲胺酯酮醛胺酰胺醇酚羧酸仪器分析dxie22第十八章经典液相色谱法流动相的极性强极性流动相占据吸附中心的能力强，其洗脱能力强，使组分的K值小，保留时间短。石油醚环已烷二硫化碳三氯乙烷苯甲苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮正丁醇乙醇甲醇吡啶酸仪器分析dxie23第十八章经典液相色谱法二元和多元展开剂比例较大的主要溶剂起溶解样品和基本分离的作用，一般选用不易形成氢键或极性比待分离组分弱的溶剂。比例较小的溶剂起调节Rf值、改善分离和对某些组分的选择性作用。中等极性的溶剂起到使极性差异较大的溶剂混合均匀的作用。加入小量酸、碱可使斑点集中，提高分离度。如：环已烷-丙酮-二乙胺-水(10︰5︰2︰5)仪器分析dxie24第十八章经典液相色谱法三、薄层色谱操作方法薄层板的制备样品液的制备点样展开和展开剂的流速显色仪器分析dxie25第十八章经典液相色谱法1、薄层板的制备载板的准备：表面光滑、平整清洁的玻璃板或塑料板或金属铝箔板。5×20、10×20、20×20cm软板的制备粘合板的制备粘合剂：煅石膏、0.2～0.5%羧甲基纤维素(CMC-Na)倾注法制板平铺法制板机械法涂铺法制板活化：凉干、105～110℃、0.5～1小时。仪器分析dxie26第十八章经典液相色谱法2、样品的制备一般用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等挥发性有机溶剂，最好用与展开剂极性相似的溶剂，尽量避免用水作溶剂。样品液浓度一般为0.01~0.1%仪器分析dxie27第十八章经典液相色谱法3、点样点样量：几至几十微克原点面积：越小越好，一般不超过2～3mm点样位置：距底边1.5～2cm处定性：薄板、点样量小定量：厚板、点样量多点样工具：点样毛细管(0.5mm)、微量点样器仪器分析dxie28第十八章经典液相色谱法展开剂的流速k0为渗透常数，dP为平均颗粒直径，γ为展开剂表面张力，η为展开剂粘度，θ为展开剂与固定相的接触角。cos2221)(002121210ptdkkLktkdtdLUktL仪器分析dxie29第十八章经典液相色谱法5、显色日光下观察有色物质的色斑紫外灯下观察荧光或无荧光色斑通用显色剂：碘、硫酸、荧光黄专用显色剂：茚三酮、三氯化铁显色方法：直接喷雾法、浸渍法仪器分析dxie30第十八章经典液相色谱法四、定性与定量分析方法1、定性分析方法依据：在固定的色谱条件下，相同物质的Rf值相同。已知物对照法：Rf值不同：不是同一物质；几种性质不同的展开剂或性质不同的吸附剂展开，若二者的Rf值都一致，同时又对多种显色剂有相同的反应，被测物与对照品为同一物质否定的结论比肯定的结论更可靠。仪器分析dxie31第十八章经典液相色谱法仪器检测法在线检测薄层扫描、TLC-UV、TLC-F、TLC-IR、TLC-MS非在线检测展开后取下斑点，将组分洗脱，再用化学方法或UV、IR、MS等进行检测仪器分析dxie32第十八章经典液相色谱法2、定量分析方法洗脱测定法分离、斑点定位、洗脱、测定直接测定法目视法：直接比较样品斑点与对照品斑点的颜色深度或面积大小；薄层扫描法仪器分析dxie33第十八章经典液相色谱法五、高效薄层色谱法(HPTLC)1、高效薄层板由较小颗粒的吸附剂(或其他固定相)用喷雾法制备而成的均匀薄层。2、点样要求：原点直径小；铂-铱合金点样毛细管、专用点样器仪器分析dxie34第十八章经典液相色谱法五、高效薄层色谱法(HPTLC)3、展开直线式、离心式、向心式4、定量方式：薄层扫描仪器分析dxie35第十八章经典液相色谱法5、定量分析方法外标一点法用一个浓度的对照品，同时在板上分别点样斑3～4个和对照品斑点3～4个，测得各自峰面积，并求出平均值，用下式计算：标样标样AAmm仪器分析dxie36第十八章经典液相色谱法外标两点法用两种浓度的对照品溶液或一种浓度两种点样量与样品溶液对比定量。112121bAmaAAmmbbAam样样仪器分析dxie37第十八章经典液相色谱法七、薄层色谱的应用及实例判断合成反应进行的程度12345吸附剂：硅胶-CMC展开剂：环已烷-苯-二乙胺(8︰2︰0.4)显色剂：碘化铋钾1、盐酸普鲁卡因2、硝基卡因3、还原2小时取样4、还原3小时取样5、还原4小时取样仪器分析dxie38第十八章经典液相色谱法天然药物成分的分离与提纯摸索色谱条件；监视分离提纯的程度12吸附剂：中性氧化铝展开剂：二甲苯-丙酮-无水乙醇-二乙胺(50︰40︰10︰0.6)显色剂：改良碘化铋钾1、含有莨菪碱的提取液2、最佳方案提取液仪器分析dxie39第十八章经典液相色谱法第三节纸色谱法一、基本原理纸色谱法可视为溶质在固定相和流动相之间的连续分配（萃取）的过程，由于组分在两相间的分配系数不同，因而随展开剂迁移的速度不同而达到分离的目的。固定相：滤纸纤维上吸附的水分流动相：与水不混溶的有机溶剂仪器分析dxie40第十八章经典液相色谱法1、Rf值与分配系数的关系2、影响Rf值的因素极性强（或亲水性强）的化合物，分配系数也大，Rf值就小；极性弱（亲脂性强）的化合物，分配系数小，Rf值就大。k11RKVVVRfSmmf仪器分析dxie41第十八章经典液相色谱法OHOHOHOHCHCHOCHCHCHCH2OHOHOHOHOHCHCHOCHCHCHCH3OHOHOHCH2CHOCHCHCHCH3葡萄糖鼠李糖毛地黄毒糖分子中羟基数543亲脂性基团－－CH3－CH2－－CH3分子极性最强其次最弱Rf值最小其次最大仪器分析dxie42第十八章经典液相色谱法色谱条件影响展开剂的极性增强，亲水性极性物质的Rf值就会加大；展开前应让展开蒸气使展开槽和色谱纸表面饱和。展时保持温度恒定。仪器分析dxie43第十八章经典液相色谱法二、实验方法1、色谱滤纸的选择质地均匀、平整无折痕；纸质的松紧和厚度适宜；纸质要纯，并无明显的荧光斑点，不含填充剂，灰分及金属离子含量符合要求；不易断裂，有一定的机械强度。Rf值相差很小的混合物宜采用慢速滤纸；Rf值相差较大的混合物可选用快速或中速滤纸。仪器分析dxie44第十八章经典液相色谱法2、点样方法3、展开剂水饱和的正丁醇、正戊醇、酚等。4、展开方式上行展开、下行展开、双向展开、径向展开仪器分析dxie45第十八章经典液相色谱法5、定位方式喷雾法、浸渍法注意：不能使用带有