肺结核的新诊断技术

新诊断技术及其在NTP中的应用江苏省结核病参比实验室NTP中现行实验室技术•涂片：萋尼染色显微镜检•培养：固体培养基：简单法、离心法•药敏：固体培养基：绝对浓度法、比例法•菌种鉴定：鉴别培养基＋生化试验传统实验室技术不能适应不断深入的结核病防治工作的需要实验室新诊断技术总览•细菌学检测方法–发光二极管荧光显微镜（LED）–液体培养•分子生物学检测方法–Genexpert–HAIN–Genechip•免疫学检测方法–ELISOPT&TSPOT和Quantiferon–血清学诊断方法荧光比色(MIGIT)(MBBactAlert)RutheniumcomplexCO2pH液体培养BACTECTB460原理：标本经前处理接种至含有14C-棕榈酸的12B培养基，37C培养。分枝杆菌分解14C-棕榈酸，产生14CO2，BACTECTB460仪自动检测，14CO2含量，并换算成生长指数（GI）。优点：快速：将分离培养的阳性检出时间由常规培养所需的2-8周缩短至3-14天，将药敏试验的报告时间由常规方法的4周缩短至1周。操作简便、灵敏度高，可进一步做药敏试验、菌种初步鉴定。缺点：放射性同位素污染。仪器与试剂价格昂贵。未实现全自动化污染率高原理：是BACTECTB460的换代产品。标本经前处理后接种到系统配套的液体培养基，该培养基中包被有对氧浓度敏感的荧光物质，当细菌生长代谢消耗培养基中的氧时，氧浓度降低，荧光被激发，系统可以连续检测荧光水平，自动报告结果。优点：系统进一步优化，操作更简便、自动化更强。解决了BACTECTB460的同位素污染问题。24小时连续检测，有利于早期报告阳性结果。缺点：仪器与试剂价格更昂贵。未能解决高污染率的问题BACTECMGIT960分枝杆菌生长指示管液体培养1CrucianiM,etal.JCM2004;42:2321-23252Meanof14studiesinMGIT960=10.7%(2.0-30.0)[]=acceptablerange培养方法敏感性(95%CI)结果报告周期污染(%)涂阳涂阴罗氏培养0.76(0.73-0.79)22.333.7[3–5]MGIT9600.88(0.84-0.91)11.716.513.8-16.6210.7(2.0-30.0)[5–10]MGIT+罗氏0.92(0.87-0.95)MGIT7mlMGIT7mlMGIT7mlMGIT7mlMGIT7mlMGIT7mlMGIT7ml+SMGIT7ml+IMGIT7ml+RMGIT7ml+EGCSIRE0,8mlBACTECMGITSIRE补充剂每种药物0,1ml转移0,5ml阳性MGIT培养物0,1ml阳性MGIT培养物9,9ml蒸馏水转移0,5ml插入BACTECMGIT960BACTECMGIT960TB–药敏试验S.I.R.E.LED显微镜•发光二级管(LED)技术–提供价廉、稳定的光源–寿命150,000h–反复开关不影响寿命•不释放有毒气体•不需要暗室•操作人员工作负荷减轻快速药敏-商业化线性探针检测（LPAs）•GenoType®MTBDRplus,HAIN–检测结核分枝杆菌复合群以及利福平、异烟肼耐药相关的突变–检测XDR的试剂盒也已经发布•INNO-LipaRifTB–检测结核分枝杆菌复合群以及于利福平耐药相关的突变–大多数利福平耐药的菌株同时也耐异烟肼•WHO鼓励使用的工具•可使用涂阳痰标本和培养物进行操作•快速、简便易用，仅需基本PCR技术•然而，价格比较昂贵，且不能检测造成耐药突变的热点区域外的突变11MTBDRplus操作流程1)DNA提取用NALC/NaOH处理痰标本2)PCR扩增3)杂交扩增产物和固化在膜上的特异性探针杂交4)结果判读rpoB野生型探针:WT1-WT8rpoB突变探针:MUT1-3:D516V,H526Y,H526D,S531L→野生型缺失→野生型突变MTBDRplusrpoB511513516518522526531533rpoBWT2rpoBWT4rpoBWT6rpoBWT8rpoBWT7rpoBMUT1(D516V)rpoBMUT3(S531L)rpoBMUT2A(H526Y)rpoBMUT2B(H526D)514515rpoBWT1rpoBWT3rpoBWT5509508505katG基因突变MTBDRpluskatG野生探针区域突变探针突变KatGWT315KatGMUT1S315T1KatGMUT2S315T2MTBDRplusinhA野生探针区域突变探针突变InhAWT1-15InhAMUT1C15T-16InhAMUT2A16GInhAWT2-8InhAMUT3AT8CInhAMUT3BT8AinhA基因突变MTBDRplus反应条带(示范)南非的经验：•GenotypeMTBDRplusassay:–直接从涂片阳性标本中检测rpob基因突变(耐利福平),katG基因(高浓度异烟肼耐药),inhA基因(低浓度异烟肼耐药)•灵敏度、特异度，阳性预测值、阴性预测值–耐利福平98.9,99.4,97.9,和99.7–耐异烟肼94.2,99.7,99.1,和97.9–耐MDR-TB98.8,100,100,和99.7BarnardM,etal.AmJRespirCritCareMed2008;177:787-92结核耐药检测基因芯片激光共焦扫描仪软件判读结核耐药检测芯片获北京市自主创新产品证书样品制备仪杂交仪通量：两个一线抗结核药速度：6小时（比传统药敏试验法快50-100倍）灵敏度：103CFU/反应特异性：对照设计严谨；自动判读基于rpoB/katG/inhA的基因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核杆菌多药耐药（利福平、异烟肼）。InternationalJournalofTuberculosisandLungDisease,13:914-920,2009（IF=2.3）18获国家医疗器械证书和欧盟CE认证XpertMTB/RIF•检测结核分枝杆菌•检测利福平耐药•直接标本检测•100分钟可获得结果工作流程•痰•简单，仅需1个步骤的准备工作•获得结果的时间90min•工作量:16样本/天/模块•不需要生物安全规•综合控制性能•对MTB特异•敏感性与培养相似•通过rpoB基因检测利福平耐药产品和系统设计•GeneXpert系统的检测模块•测试模块的扩大和交换•对非分枝杆菌实验室人员仅需要最多1天的培训GeneXpert样本准备、扩增、检测自动化MTB/利福平耐药性检测痰标本可以直接放入模块中，而无需与任何试剂进行混合处理报告结果时间:1h45minGeneXpertDNA分子与PCR试剂混合样本自动过滤和清洗超声裂解捕获的生物体，释放DNA半嵌套实时PCR扩增&检测集成反应管456浓缩细菌去除抑制剂12标本液化和作用15分钟后转移2ml3结束手工工作结果可打印XpertMTB/RIF单中心评估研究（初步结果）不同研究设计和研究人群，肺结核和肺外结核标本检测结核•汇总的未经校正的敏感性92%•汇总的未经校正的特异性98%检测利福平耐药•汇总的未经校正的敏感性98%•汇总的未经校正的特异性99%操作方面•废弃物管理–如痰标本容器•储存和供应–反应盒庞大,2-28°C,有效期12个月•电力供应–UPS(400VA)或电池组•培训–需求不高(使用计算机、预防污染)•生物安全–与涂片镜检相同•每年校正–模块更换•安全–防盗(计算机)世界卫生组织快速开展XpertMTB/RIF诊断试验技术和实施方面的考虑2011年3月WHO对XpertMTB/RIF的建议摘要：•高度推荐用于怀疑MDR-TB以及合并HIV感染的结核病病人的初诊诊断•对于MDR－TB、HIV不严重的地区，可以在涂片之后考虑使用XpertMTB/RIF，特别是用于诊断涂阴病人（取决于费用）•肺外标本的有关证据尚有限•增加检测次数可能增加敏感性，但需考虑费用增加•适用于儿童•不能替代传统涂片、培养、药敏试验步骤1:特异抗原激发淋巴细胞IFN-释放阴性对照ESAT-6或CFP-10孵育孵育显影步骤2:用ELISA检测IFN-YYYYYY洗涤YYY洗涤YYYQuantiFERONTBGold™实验T-SPOTTB(ELISPOT)技术单核细胞分离TB抗原刺激，IFN-释放一抗捕获IFN-与标记的二抗结合酶作用标记物－显色每一斑点代表释放IFN-的一个细胞YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYIFN-抗原小结用途操作生物安全要求费用液体培养更敏感、快速的培养＋＋＋＋＋＋＋＋LPA/基因芯片快速诊断M/XDR＋＋＋＋＋＋＋LED涂阳病人发现＋＋＋＋Xpert快速诊断＋＋＋＋＋NTP中如何应用－给谁用？哪里做？怎么用？国家结核病参比实验室推荐建议液体培养用于:结核病可疑症状者检查,可以作为结核病（耐药）的诊断依据和结核病患者治疗效果判断,液体培养可以代替传统培养推荐理由:1.液体培养在已经在我国注册；2.国内外研究显示其敏感性和TAT优于传统培养；3.数据显示在我国具有可行性,符合成本效果；推荐使用层级:区县、地市和省级（医疗机构和疾病预防机构）国家结核病参比实验室推荐建议GenXpert即将可以用于:结核病可疑症状者检查,可以作为结核病的辅助诊断方法和结核病患者治疗效果判断,它有望代替传统的培养和利福平的药敏试验（可疑耐药结核病患者）推荐理由:1.即将在我国获得注册证书；2.国内外研究显示其敏感性和特异性，阳性结果报告时间优于传统方法；3.WHO在全球推荐4.数据显示在我国具有可行性,符合成本效果；可能使用层级:区县（？）、地市和省级（医疗机构和疾病预防机构）国家结核病参比实验室推荐建议LPA可以用于:可疑耐药结核病患者查,它有望代替利福平和异烟肼的传统药敏试验推荐理由:1.在我国获得注册证书；2.国内外研究显示其敏感性和特异性（TAT)较好；3.WHO在全球推荐4.数据显示在我国具有可行性,符合成本效果；可能使用层级:地市和省级（医疗机构和疾病预防机构）国家结核病参比实验室推荐建议基因芯片可以用于:可疑耐药结核病患者查,它有望代替利福平和异烟肼的传统药敏试验推荐理由:1.在我国获得注册证书；2.国内研究显示其敏感性和特异性和(TAT)较好；3.民族品牌4.数据显示在我国具有可行性,符合成本效果；可能使用层级:地市和省级（医疗机构和疾病预防机构）国家结核病参比实验室推荐建议γ干扰素释放试验可以用于:结核菌潜伏感染筛查,儿童和老年人以及免疫力低下者结核病的辅助诊断（参考）推荐理由:1.在我国获得注册证书，国家对一些特殊诊断试剂的规定；2.国内外研究显示其敏感性和（特异性）较好；3.数据显示在我国具有可行性可能使用层级:县区、地市和省级（医疗机构和疾病预防机构）我国新诊断技术应用设想1.根据国家结核病防治规划的需要，按照不同级别的实验室职能定位选择相应的（通过系统评估）适宜新诊断方法；2.依据各地实际情况，在县级同时开展培养，地市级同时开展药敏试验工作。依据：1.尽管新诊断技术快简和灵敏，目前还没有哪种新技术的灵敏度和特异性都完全超过传统培养；2.耐多药结核病的治疗需要关注其他抗结核药物的耐药谱3.目前的分子生物学方法的结果还不足以作为疗效评价的指标4.疾病的分子监测和动态趋势，需要分离病原体