多色检测与光谱检测

多色检测与光谱检测1多色检测1.1多色检测简介多色检测主要为多色荧光检测，其利用了某些物质可以在特定波长范围内的光的激励下产生荧光，通过测量荧光的颜色（即频率）以及强度，可以对多种物质同时进行定性或定量的分析。这种光检测方法主要应用在化学及生物医学领域，可以对物质的反应、合成过程以及生理过程进行定性及定量的分析。多色检测主要可分为荧光激发光谱检测和荧光发射光谱检测两种类别，一般会借助于荧光分光光度计。多色检测的主要方法为，采用多个具有不同荧光发光波长，但激发波长处于同一范围内的化合物对生物目标分子进行标记，从而可以同时监测样品中不同的生物组成成分或官能团。通过不同的颜色标记，可以同时检测多种样品中的同类别被分析物，也可以检测某一样品中的不同类别被分析物。目前，多采用荧光蛋白、小分子有机荧光染料对细胞等进行标记，使用荧光基团对分子进行标记。1.2多色检测实例的介绍多色荧光标记的DNA自动测序：首先为DNA复制的过程提供带有荧光标记的脱氧核糖核苷酸，带有不同碱基的核苷酸标记颜色不同，进行DNA复制。随后进行电泳，电极间的电势差推动各个荧光DNA片段从负极到正极泳动并分离，依次通过检测窗口。激光器发出的光激发荧光基团发出特定波长的光，经过光栅分光后采集荧光信号。电泳过程结束后采集到的荧光信号即为一个以时间为横坐标，荧光波长种类和强度为纵坐标的信号数据的集合，从发光波长和强度的变化可以获得DNA的序列。多色流式细胞检测技术：流式细胞检测技术可以对细胞进行计数、分选等操作，也可以对细胞中的蛋白质和核酸进行定量的研究。流式细胞检测技术借助流式细胞仪，其内部过程与DNA自动测序相似，也是在使用荧光物质对细胞或蛋白质等物质进行标记以后，进入流动系统，使用激光源对荧光物质进行激发，采集光信号并进行处理。通过对荧光信号波长和强度进行分析，可以获得细胞或物质的种类以及计数等信息。流式细胞检测中采用多色标记的意义在于，相比于单色标记，多色标记可以提高识别的准确性，对细胞亚群的分选以及细胞功能的评价会更加精确，例如，淋巴细胞亚群的分析、白血病免疫表型分析，均应使用至少三色以上的荧光分析才更可靠。此外，还可以提高标本的利用率，节约大量的实验时间，充分利用流式细胞仪的性能。2光谱检测2.1光谱检测简介不同元素的原子可以从基态被特定波长的光激发到激发态，也可以由激发态辐射出特定波长的光而跃迁到基态。不同的原子有不同的吸收或激发的特征谱线，获得了特征谱线，就可以根据谱线的类别及强度对元素的种类和含量进行分析。光谱检测要使用光谱仪，主要可以分为发射光谱检测，吸收光谱检测，漫反射光谱检测以及荧光光谱检测等类别。光谱检测广泛应用于化学元素的检测，包括对未知试样进行检测与对太空中天体的元素含量进行检测，同时光谱成像技术也可应用于地质调查、植被研究、矿藏分布探明、大气有害气体检测等地球科学领域。根据检测的光谱类型进行分类：原子发射光谱分析法：可多元素同时检测，各元素有各自的特征光谱；具有分析速度快，选择性高，准确度高，检出限低等优势。吸收光谱法：基态原子或分子吸收其共振辐射，外层电子由基态跃迁至激发态而产生原子吸收作用，通过吸收光谱强度的测量可以获得物质的含量信息。漫反射光谱分析法：漫反射光谱与物质的电子结构有关，由于电子的跃迁，物质可能会在紫外区和可见光区及红外区产生漫反射吸收光谱。由于其属于反射光谱，因而对于不透光的固体或浑浊液体，无法对其吸收光谱进行测量，可以利用漫反射光谱分析的方法。荧光光谱分析：荧光光谱分析的原理其实是前面多色检测的基础，即不同的物质在特定波长的光的激发下会产生特定波长的光，通过对这些光的频率进行分析，也可以确定物质的种类。对于光谱的探测技术，可以分为基于色散分光光谱探测技术和基于相干探测光谱检测技术（傅里叶光谱技术）。色散分光探测光谱的系统主要由光源、分光计和探测器三个部分组成，通过分光计将复色光分解为单色光，从而进行光谱的检测。傅里叶光谱技术不采用非空间色散分光，结构如下图：光源为宽带光源，干涉仪为迈克尔逊干涉仪，不同频率的光在试样处有不同的干涉强度。其中一面反射镜为动镜，改变该反射镜位置，会使得不同频率的光在试样处达到干涉极大。通过检测通过试样后的光强，可以获得干涉光强序列，对其进行傅里叶变换可以获得吸收光谱。2.2光谱检测实例的介绍以原子吸收光谱法检测为例：基本原理：基态原子对光有吸收作用，例如原子对其共振频率附近的光有吸收作用，外层电子吸收一定波长的光可以从基态跃迁到激发态。由于每一种原子有其特征谱线，因而可以根据吸收光谱确定含有原子的种类，也可以根据谱线被减弱的程度可以对待测元素进行定量的分析。不过，原子吸收光谱法主要是指利用特定频率的光源对被测物的吸收该波长光的强度进行分析，从而获得被测物的含量。发展过程：最先观察到太阳光谱暗线，后来得到解释，该暗线形成的原因是大气中钠原子吸收结果，从而发现了吸收光谱现象。后来，空心阴极灯的发明为原子吸收光谱法提供了光源，而电热原子化技术（即将待测物质变为原子蒸气）提高了原子吸收的灵敏度。以上进展为原子吸收光谱法检测提供了原理以及技术支持。检测系统：主要由光源、原子化系统、分光系统和检测系统等部分组成。对于定量检测，光谱的吸收强度与物质的浓度成正比，因而可以通过制备标准溶液对物质的含量进行定量测量。主要过程：使用原子化系统将试样干燥，蒸干，并原子化，光源波长在待测元素吸收波长处，且其光谱的半高全宽应小于待测物吸收光谱吸收峰的半高全宽。光通过待测物被吸收一定强度后到达分光器，一般在分光器之前还要放置一个光栅，以阻止不需要的波长进入分光器。经过分光后的吸收频率对应的光束进入光电探测器，测量光的强度，经过处理获得待测物对光的吸收强度，再经过计算可以得到待测物的含量。参考资料：刘华峰.光电检测技术及系统[M].浙江大学出版社,2015.张广军.光电测试技术与系统[M].北京航空航天大学出版社,2010.邹阳.新型多色标记和荧光成像标记物研究[D].暨南大学,2014.以及维基百科、百度文库等各方面网络资料