Accuri-C6流式细胞仪的应用

AccuriC6流式细胞仪的应用ApplicationsofAccuriC6主讲人：陈慧中国医学科学院基础医学研究所中心实验室2010年北京中心实验室实验技术系列讲座第二讲AccuriC6的基本情况AccuriC6BDFACSAriaCoulterEpicsXLAccuriC6的优点数据分析软件PMT电压调节自动进样分析模块开机预热时间脱机补偿功能细胞分选功能激光管及荧光通道价格仪器体积及重量上百万，一般为公用大约30万人民币，适合实验室使用大很多，重很多27.9×36.3×41.9cm，13.6kgBDFACSAriaAccuriC6无有，CFlowSample，96孔板至少需要15min快速，5min有有可以安装三个激光管（加上紫外），蓝光有五个检测通道，将600nm的信号分为三组，红光有两个通道，多加了735nm的APC-CY7488nm蓝色激光：FL1：530±15nm(FITC、GFP)FL2：585±20nm(PE、PI)FL3：670nm(PE-CY5、PE-CY7)640nm红色激光：FL1：675±12.5nm(APC)必须联机使用，加密可以脱机使用，没有加密，安装即用需要不需要（对于初学者，不会丢失任何有用的细胞信息）有无AccuriC6的软件操作界面控制区域数据区域控制区域样品命名框96孔样品格1、每一个孔代表一个样品；2、收集了数据后，对应孔成为蓝色；3、红框选中，查看样品检测结果；状态信息信号灯、有错误，没有准备好废液满了，鞘液没了，计算机和仪器没有连接好等。、某种操作正在相应，请稍候正在开机预热，正在关机，正在进行清洗等。、仪器已经就绪，可以开始检测了控制区域数据区域图区统计数据区启动AccuriC6启动控制计算机，进入软件，此时信号灯为红灯，显示还没有与C6连接。检查四个液体容器，如有需要，则先充满液体或清空废液。启动C6前方的电源按钮，此时信号灯变为黄色，显示C6正在启动，等待3分钟左右直至信号灯变绿，显示C6已经连接并就绪。在载物台上放置一个空管，点击控制区Backflush按钮，可以看到少许液体流出来。在96孔样品格中任选一孔，载物台换上去离子水，选择高速，10分钟，点击RUN。（激光器预热）该孔因为收集了数据变成蓝色，点击DeleteSampleData删除。至此启动步骤已完成，可以开始检测样品。关闭AccuriC6在任意一个打开的文件下，在96孔样品格中任选一孔，载物台上放置洗液（0.1%次氯酸钠），选择高速，运行2分钟。在96孔样品格中任选一孔，载物台换上去离子水，选择高速，运行2分钟。将去离子水的检测管一直留在载物台上。按一下C6前方的电源按钮关闭C6，此时信号灯为黄灯，显示C6正在关闭，关闭的过程大约需要10分钟左右。退出控制软件，不用保存之前清洗步骤所收集的数据。关闭电脑。注意：与BDFACSAria不同，C6的关机程序所作的一系列相关步骤都是自动的，不需要与控制计算机相连接操作，C6与电脑控制软件相对独立，所以后面两个步骤（关闭C6和退出控制软件）无关先后。检测样品将样品依次置于载物台上。在96孔样品格中选择不同的位置，依次命名。设定检测停止的条件：1、无限制，手动点击停止；2、收集了多少个点停止；3、收集了多少时间停止；4、收集了多少体积液体停止。（2—4可复选，达到任一设定指标就会停止）设定进样速度：慢速，中速，快速或者自己设定。设定阈值（一般不变，FCS-H80000）。点击RUN。注意事项：1、样品之间无需用去离子水冲洗，但是当你完成所有样品检测后，必须运行清洗程序（Instrument菜单下cleaningfluidcycle）。2、若发生堵塞（观察每秒钟细胞数），则运行Backflush，再用去离子水冲洗2min。3、切记每测完一个样品必须保存（在开始检测时会提示你保存）。检测结果的分析1、对于系统默认的FSC/SSC散点图：缩放工具——将目的区域放大圈门工具——圈出目的细胞群通过数量化方式更精确的显示目标区域。检测结果的分析2、新建荧光信号图（单色：直方图，双色：散点图）改坐标（可以命名为自己标记的分子）设定显示细胞群（点击图形上方GATE）根据对照划定阴阳分界点检测结果的分析单色直方图1、竖门，横门2、缩放目的区域检测结果的分析3、调节补偿（双色以上）检测结果的分析4、图形的叠加点选Analyze选项卡，点击CopyPlotsfromCollect，在下方的PlotList中会出现所选择的图。选择右边一个空白图形框，然后点选96孔样品格指定要显示哪个样品（会被勾上），点选PlotList指定要显示该样品的哪个参数图（会变成红色），在空白的图形框中就会出现相应的图。需要叠加图时，利用叠图按钮。默认为一个横坐标为FSC-A的图，将坐标轴改为你想要叠加的图的横坐标，然后在96格中直接勾选要叠图的样品。可以通过叠图下方的标识按钮查看不同颜色所代表的样品。检测结果的分析5、数据结果的统计学分析分为五个区域：A：图形预览B：图形列表C：图形参数列表D：样品列表E：用户自定义统计表格检测结果的分析检测结果的分析6、数据及图形的输出图形：可以通过拖拽的方式直接以图形文件的格式输出到word，excel，powerpoint，也可以输出到图片处理软件（例如：画图板）。数据：可以通过复制粘贴（control+C/control+V）的方式以表格的形式输出到word，excel，powerpoint中。其他输出方式：直接打印勾选需要打印的图片/表格左上方的空白方格（选择了图，相应的数据表格也被选上），点击文件菜单下的打印被选择的项目。如果你最近所做的都是重复实验，可以将所有的分析保存模板！C6的质量控制（QC）QC：保证激光管照射细胞流的位置，检查仪器流路是否清洁（BlueLaser：8-peakbeadsRedLaser：6-peakbeads）运行条件：低速，收集数量50000合格条件：荧光强度最大的峰的CV值5%C6的质量控制（QC）CV值变大的可能原因：运行的时候进样速度不是slow——选择slow进行检测的beads时间太长——重新配新的beads仪器的流路中有气泡——运行unclog+backflush程序仪器的流路不干净——运行清洗程序仪器的激光位置发生偏移——用工具调节激光的位置CFlowSampler流式检测的自动化革命！！