(701)菌落总数测定操作程序ZL-SOP-QC-701A

编码：ZL-SOP-QC-701A菌落总数测定操作程序1.目的：建立菌落总数测定的标准操作程序，保证正确操作。2.适用范围：本标准适用于菌落总数的测定。3.职责：质量技术部QC4.引用标准：GB-4789.2-2010食品微生物学检验菌落总数测定5.内容5.1菌落总数：食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。5.2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：⑴恒温培养箱：36℃±1℃，30℃±1℃。⑵冰箱：2℃～5℃。⑶恒温水浴箱：46℃±1℃。⑷天平：感量为0.1g。⑸均质器。⑹振荡器。⑺无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。⑻无菌锥形瓶：容量250mL、500mL。⑼无菌培养皿：直径90mm。⑽pH计或pH比色管或精密pH试纸。⑾放大镜或/和菌落计数器。5.3培养基和试剂5.3.1平板计数琼脂培养基：见附录A中A.1。5.3.2磷酸盐缓冲液：见附录A中A.2。5.3.3无菌生理盐水：见附录A中A.3。5.4检验程序编码：ZL-SOP-QC-701A菌落总数的检验程序见图1检样25g(mL)样品+225mL稀释液，均质↓10倍系列稀释↓选择2~3个适宜稀释度的样品匀液，各取1mL分别加入无菌培养皿内↓每皿中加入15mL～20mL平板计数琼脂培养基，混匀↓培养↓计数个平板菌落数↓计算菌落总数↓报告图1菌落总数的检验程序5.5操作步骤5.5.1样品的稀释⑴固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。⑵液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。编码：ZL-SOP-QC-701A⑶用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。⑷按6.1.3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。⑸根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。⑹及时将15mL～20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。5.5.2培养⑴待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48h±2h。水产品30℃±1℃培养72h±3h。⑵如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL），凝固后翻转平板，按6.2.1条件进行培养。5.6菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits，CFU）表示。⑴选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。⑵其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。⑶当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。5.7结果与报告5.7.1菌落总数的计算方法⑴若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。编码：ZL-SOP-QC-701A⑵若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：N=dnnC)1.0(21…………………………………（1）式中：N——样品中菌落数；∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d——稀释因子（第一稀释度）。⑶若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。⑷若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。⑸若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。⑹若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU～300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。5.7.2菌落总数的报告⑴菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。⑵菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。编码：ZL-SOP-QC-701A⑶若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。⑷若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。⑸称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。编码：ZL-SOP-QC-701A附录（规范性附录）培养基和试剂A.1平板计数琼脂（platecountagar，PCA）培养基A.1.1成分胰蛋白胨5.0g酵母浸膏2.5g葡萄糖1.0g琼脂15.0g蒸馏水1000mLpH7.0±0.2A.1.2制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。分装试管或锥形瓶，121℃高压灭菌15min。A.2磷酸盐缓冲液A.2.1成分磷酸二氢钾（KH2PO4）34.0g蒸馏水500mLpH7.2A.2.2制法贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH，用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。稀释液：取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15min。A.3无菌生理盐水A.3.1成分氯化钠8.5g蒸馏水1000mLA.3.2制法称取8.5ｇ氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。