各种酶活力测定方法及注意事项

碱性蛋白酶及各种蛋白酶活力测定方法及测定有感因长期测定碱性蛋白酶酶活力与角蛋白酶活力与胶原酶活力和弹性蛋白酶活力，碱性蛋白酶活力测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可大大减少误差。其余酶活力测定过程中因无统一标准且底物差异大，导致长期酶活力测定的混乱，各种酶活力测定方法与各种试剂添加，最后实际测定的酶活力只能仅作参考。以下是各种蛋白酶活力测定方法及标曲绘制：碱性蛋白酶测定方法根据国标GB/T23527-2009附录B蛋白酶活力测定福林法以下是方法碱性蛋白酶的测定方法参考GB/T23527-2009附录B中福林酚法进行，即1个酶活力单位（U/mL）定义为1mL酶液在40℃、pH=10.5条件下反应1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。2.2.6.1标准曲线的绘制（1）L-酪氨酸标准溶液：按表2-6配制。表2-6L-酪氨酸标准溶液配置表Table2-6L-Tyrosinestandardsolutionform管号酪氨酸标准溶液的浓度/（μg/mL）取100μg/mL酪氨酸标准溶液的体积/（mL）取水的体积/（mL）000101101922028330374404655055（2）分别取上述溶液各1.00mL，各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.0mL，福林试剂使用液1.00mL，置于40℃±0.2℃水浴锅中显色20min，用分光光度计于波长680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的反应管作为空白，分别测定其吸光度值，以吸光度值A为纵坐标，酪氨酸浓度C为横坐标，绘制L-酪氨酸标准曲线。图2-1L-酪氨酸标准曲线Fig.2-1L-tyrosinestandardcurve根据作图或用回归方程计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），既为吸光度常数K值。其K值应在95-100范围内。上图所示标准曲线符合要求，可用于下一步实验。2.2.6.2测定方法（1）计算方法X=A×K×4/10×n=2/5×A×K×n式（2-1）式中，X—样品的酶活力，μ/g；A—样品平行实验的平均吸光度；K—吸光常数；4—反应试剂的总体积，mL；10—反应时间10min，以1min计；n—稀释倍数。（2）测定方法①先将干酪素溶液放入40℃±0.2℃恒温水浴中，预热5min。②按下列程序操作，进行测定。于680nm波长，用10mm比色皿测其吸光度。角蛋白酶活力的测定1、角蛋白酶活力测定方法试剂和溶液：a.硼酸缓冲溶液（pH10.5）：称取硼酸钠9.54g，氢氧化钠1.6g，加水至900mL，搅拌均匀。用1mol/L盐酸溶液或0.5mol/L氢氧化钠溶液调整pH=10.5±0.05，试管A（空白）试管B（样品）酶液1.00mL预热2min酶液1.00mL预热2min三氯乙酸2.00mL混匀保温10min干酪素1.00mL混匀保温10min干酪素1.00mL混匀三氯乙酸2.00mL混匀10000r/min离心2min10000r/min离心2min滤液1.00mL加碳酸钠溶液5.00mL滤液1.00mL加碳酸钠溶液5.00mL加福林试剂1.00mL显色20min加福林试剂1.00mL显色20min定容至1000mL。b.硼酸缓冲溶液（pH9.5、11.5）：称取硼酸钠9.54g，加水至800mL，用氢氧化钠溶液调整pH=9.5±0.05或pH=11.5±0.05，定容至1000mL。c.10%三氯乙酸：10g三氯乙酸，加水至100mL。d.0.5%羊毛角蛋白溶液：取0.5g羊毛角蛋白加入100ml硼酸缓冲液溶解测定方法：取1mL酶液（0.1g酶粉用对应pH缓冲液溶解离心，取上清液适当稀释），取4支具塞试管中，空白加1mL酶液、2mL0.5%羊毛角蛋白溶液（pH10.5、硼酸缓冲液溶解）、2mL10%三氯乙酸，对照加入1ml酶液和2ml角蛋白溶液，在40℃恒温水浴锅中反应1h后对照加2mL10%三氯乙酸终止反应，在10000r/min离心10min，取上清液，过滤，在280nm处测吸光度。（使用石英比色皿）酶活定义：1ml/1g酶在该反应体系下对照相对于空白样A280nm吸光每升高0.01为1unit（U）。X=(A280-A0)×100×NN为稀释倍数胶原蛋白酶活力的测定标曲的绘制取11支试管分别标号，向每支试管中分别加入0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5mL的0.75umol/ml的标准甘氨酸溶液，并用水补足至0.5mL，各加入0.5ml乙酸-乙酸钠缓冲液（pH5.4）充分混合，最后加入0.5mL茚三酮显色液，充分混合。用试管盖盖住，在100℃下水浴加热10min，冷却放置10min，加入4.5mL乙醇（60%，v/v）进行稀释，在570nm下比色。吸光值与甘氨酸浓度标准曲线y=1.2122x+0.0135酶活X=55.7359×N×(OD-0.0135)酶活力测定发酵粗酶液12000rpm/min离心10分钟取上清（固体酶粉酶活测量时，取酶粉取0.1g，加入适当硼酸缓冲液（pH10.5）溶解并在旋涡混匀器混匀3min直至无明显固体团,并用硼酸缓冲液（pH10.5）适当稀释一定倍数，分别取0.5mL稀释后的酶液于4支试管中，将所需I型胶原和酶液于37℃下保温五分钟，然后向空白样中加入0.5mL的Ι型胶原（5mg/mL，底物溶于水中）和0.5ml的TCA，对照样中加入0.5mlI型胶原，混匀，37℃，40min，之后对照中加入0.5mL0.4M的三氯乙酸终止反应。取1ml反应后的液体于12000rpm/min离心2min，取上清0.5mL，加入0.5ml乙酸-乙酸钠缓冲液（2mol/L，pH5.4），最后加入0.5ml1%的茚三酮显色液，将试管封塞混匀，于100℃下水浴加热10min，冷却10min，加入4.5ml60%乙醇稀释于570nm以空白为零测定吸收值。根据甘氨酸标准曲线计算出酶活力大小。酶活力定义：37℃，pH7.5条件下，每分钟每毫升发酵液水解胶原产生1μg甘氨酸为一个酶活力单位。（1）三氯乙酸溶液（0.4mol/L）：准确称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000mL。（3）氢氧化钠溶液（0.5mol/L）：称取20gNaOH，用水溶解并定容至1000mL。（4）60%乙醇：量取无水乙醇60mL加水定容到100mL，待用。（5）Ι型胶原溶液：取500mgI型胶原溶于100mL磷酸缓冲液（pH7.5）中，4℃避光保存。（6）0.75μmol/mL甘氨酸标准液：称取0.2252g甘氨酸溶解后定容到100mL得到30umol/ml的甘氨酸溶液，之后取0.5ml加4.5ml水混匀稀释10倍，再从混匀后的溶液中取3ml加入9ml水混匀稀释4倍，得到0.75umol/ml的甘氨酸标准溶液。（7）茚三酮显色液：称取0.85g茚三酮二水与0.15g还原茚三酮二水溶于90mly=1.2122x+0.0135R²=0.995500.10.20.30.40.50.60.70.80.9100.10.20.30.40.50.60.70.8OD-570nmGly-umol/ml乙二醇单甲醚，定容100ml。（8）2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH5.4）：82.7mL2mol/L乙酸钠与17.3mL2mol/L乙酸混匀。（9）2mol/L乙酸钠溶液：称取82g无水乙酸钠溶于500mL水中。（10）2mol/L乙酸：量取12.01g冰乙酸加水定容至100mL。弹性蛋白酶活力的测定采用Sacher3方法并参照中国现行药用弹性蛋白酶测定方法进行。称取10mg刚果红-弹性蛋白于试管中，加2mLpH值7.4、0.2mol/L硼酸缓冲液，取1mL适当稀释酶液(固体酶粉酶活测量时，取酶粉取0.5g，加入10ml硼酸缓冲液溶解震荡溶解2min，12000rpm/min离心2min，用硼酸酸缓冲液（pH7.4）适当稀释一定倍数)于37℃下振荡反应20min，加入pH值6.0、0.2mol/L磷酸钠缓冲液2mL终止反应，离心过滤后取上清液测495nm光密度，以不加酶液和底物的反应系统为空白。在此反应条件下溶解1mg刚果红-弹性蛋白底物所需的酶量定义为一个弹性蛋白酶活性单位（U）。参照Sacher方法绘制弹性蛋白酶标准曲线.y=0.2109x（mg/ml）X=1.1854xODxN（1）0.2M硼酸缓冲液(pH7.4)：取19.07g硼砂（Na2B4O7·10H2O,MW381.37）溶于水定容1L，配置成A液，取12.37g硼酸（H3BO3,MW61.83）溶于水定容1L，配置成B液，取两种液体以A:B=1:9的比例混合并适当调节pH至7.4。（2）0.2mol/L磷酸钠缓冲液（pH6.0）:0.2M磷酸缓冲液（pH7.5）：取71.63g十二水磷酸氢二钠溶于水并定容1L水中，配置成A液，取7.8g二水磷酸二氢钠溶于水并定容于250ml水中，配置成B液，A液与B液以比例混合，并用适当的A液和B液适当微调pH至pH6.0以下说说我在碱性蛋白酶活力测定过程中出现的问题和解决方法首先我在多次测定碱性蛋白酶酶活力的过程中发现样品酶活力差异较大，甚至同一个样品酶活力也有20%-240%的大小差异，这使得我陷入思考，为什么会这样，我经过多次测定酶粉时的碱性蛋白酶活力发现同一个样品在不同稀释倍数下有不同的OD值，理论上讲同一个样品不管怎么稀释，只要OD在0.2-0.8范围内时应该根据酶活力计算公式X=4*A*N*K/10计算的结果应该无显著差异的，但是结果与预料中的不一致，以下是我选取一个碱性蛋白酶样品的酶粉，稀释不同的倍数，呈现不同的OD值，最后计算的酶活力，根据计算，发现其中的规律。首先是同一个样品在不同的稀释倍数下的OD变化02000400060000.00.20.40.60.8AXAN160001800020000220002400026000XA代表的OD680的对照对于空白的吸光值，X代表了碱性蛋白酶的酶活力，理论上随着稀释倍数增大，酶活力应该不会变化太大，结果却显示发现随着稀释倍数增大酶活力先增大后趋于稳定。后来发现溶液OD在0.2-0.4附近时酶活变化幅度较小，此时测定酶活力误差较小，当OD低于0.1时酶活又会急剧增加，高OD值时碱性蛋白酶酶活力偏低原因在于当溶液酶浓0100020003000400050006000700080000.00.20.40.60.8AXAN240002600028000300003200034000X度过高时，根据米氏方程，决定酶促反应的动力学中，酶处于过量状态，此时为零级反应，应速率受限于底物浓度，反应速率低于最大速率Vmax，随着反应进行，底物急剧消耗，底物浓度降低较快，而酶在10分钟之内并未损失太多，因此实际测量过程中当酶浓度较高时反而误差会较大，同时酪蛋白被酶水解后水解物中产生多种氨基酸，含有酚基氨基酸与福林试剂显色影响测量结果，同时受限于分光光度计的检测原理，过高或过低的OD会使得其检测时产生较大误差。对于碱性蛋白酶活力测定过程中的繁琐与反复稀释，同时酶稳定性的原因，无论是放置于保鲜冰箱或低温冰箱都会使得酶活力有较大程度的衰减，因此快速的碱性蛋白酶活力测定需要确立，对于已经干燥的酶粉或少量样品，基于其碱性蛋白酶活力测定，通过反复多次稀释并控制稀释后酶液的酶活力使得显色OD处于合理的大小会得到相对准确一些的酶活力值。但对于大量样品需要急测且并无太多时间与人力物力反复测定，且酶液随着从无菌容器取出，酶活力会快速衰退，因此快速简便准确测定同批次与不同批次、酶活力或存在较大差异样品需要测定，事物存在具有一定规律，酶促反应动力学中除开仪器、显色剂、样品本身纯度等系统误差，吸光值与稀释倍数存在一定的函数关系，因此模拟出比较适合的函数关系可通过一次简单试验短时间内确定最优稀释倍数使得稀释后酶液酶活力处于较好大小，由米氏方程实际意义，底物蛋白过量时反应为一级反应，反应速率与酶浓度线性关系较好，吸光值OD与稀释倍数N呈现反比例函数关系，当稀释后酶液浓度过大时，反应速率逐