第七章-微生物的生长及其控制2010

第七章微生物的生长及其控制生长：生物个体物质有规律地、不可逆增加，导致个体体积扩大的生物学过程。繁殖：生物个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。在高等生物里这两个过程可以明显分开，但在低等特别是在单细胞的生物里，生长和繁殖紧密联系、难以划分。微生物的生长主要指群体生长，包括个体生长和个体繁殖。第一节微生物生长的研究方法第二节微生物的生长规律第三节环境对微生物生长的影响第四节微生物生长的控制一、微生物的纯培养纯培养(pureculture):从一个细胞经过培养繁殖而得到的后代。显微操作仪：显微镜下用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子。毛细管法；小液滴法。稀释涂布法稀释倒平板法平板划线法选择培养分离法使微生物在固体培养基平板上形成单个菌落！最基本的方法：稀释！2.稀释倒平板法1.稀释涂布法使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！操作较麻烦，对好氧菌、热敏感菌效果不好！3.平板划线法4.选择培养分离法使待分离微生物生长特征“突出”；抑制大多数其它微生物的生长；微生物群落中数量占少数的微生物得到分离纯化：使待分离微生物生长更快。颜色反应：分离特定的菌株牛奶平板：分离蛋白酶产生菌使待分离微生物生长特征“突出”高温下培养：分离嗜热细菌培养基中不含N：分离固氮菌培养基加抗生素：分离抗性菌抑制大多数其它微生物的生长富集培养:利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，仅使待分离微生物旺盛生长，在群落中的数量大大增加，从而更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。使待分离微生物生长特征“突出”；抑制大多数其它微生物的生长；使待分离微生物生长更快。二、微生物的培养方法从少量培养发展到大规模培养.从浅层培养发展到厚层(固体)或深层(液体)培养.从以固体培养技术发展至液体培养为主.从静止式液体至通气搅拌式发酵.从批式至连续培养.从游离细胞至固定化细胞培养.从利用野生型菌株至工程菌株.从单菌至混合菌发酵.从微生物细胞至动植物细胞株实验室培养与工业培养好氧培养与厌氧培养固体培养与液体培养1.实验室培养固体培养法：好氧菌：试管斜面、培养皿平板、克氏扁瓶、茄子瓶等。厌氧菌：高层琼脂柱、厌氧培养皿、厌氧罐技术、Hungate滚管法和厌氧手套箱等。厌氧培养三大件：厌氧罐、Hungate滚管法厌氧手套箱。严格厌氧技术好氧菌实验室固体培养试管斜面、培养皿平板、茄子瓶厌氧菌实验室固体培养①高层琼脂柱：培养基中加入还原剂，装入试管中灭菌后，只有表层有一些溶解氧，越是深层，其氧化还原电位势越低，有利于厌氧菌的生长。如韦荣氏管（Veillontube）：长25cm，内径1cm，两端可用橡皮塞封闭的玻璃管。②厌氧培养皿：Brewer皿：利用凹形皿盖制造狭窄空间，加上还原性培养基达到厌氧环境。Spray或Bray皿：利用焦性没食子酸+NaOH反应造成无氧环境。③厌氧罐：常规的不很严格的厌氧技术；对厌氧罐反复抽真空、灌氮气，剩余氧在钯催化剂的催化下，与灌入混合气体中的氢气还原成水而除去，从而形成良好的无氧环境。④Hungate滚管技术：严格厌氧技术；利用除氧铜柱在350℃下与氧反应来制备高纯度氮，再用此高纯度氮去驱除培养基配制、分装过程中各种容器和小环境中的空气，使培养基的配制、分装、灭菌和贮存，以及接种、稀释、培养、观察、分离、移种和保藏等操作的全过程始终处于高度无氧的环境下，从而保证了严格厌氧菌的存活。⑤厌氧手套箱：箱内始终充满成分为N2：CO2：H2＝85：5：10（V/V）的气体，并有钯催化剂保证箱内处于高度无氧状态。通过塑料手套进行操作，外界物体进出通过交换室。1.实验室培养液体培养法：好氧菌：确保培养液中含有较高的溶解氧浓度是关键。试管液体培养；三角瓶浅层液体培养：一般仅适用于兼性厌氧菌；摇瓶培养：又称振荡培养；台式发酵罐：几升至几十升，使用方便厌氧菌：放入厌氧罐或厌氧手套箱中；培养基中加入巯基乙酸、半胱氨酸等有机还原剂。台式发酵罐NutrientadditionInoculationAgitationAirinletandoutletCoolingandheatingpHcontrolViewingport2.工业培养固态培养法：好氧菌：曲法培养。依制曲容器的形状和规模分为：瓶曲、袋曲、盘曲、帘子曲、转鼓曲、通风曲等。——酱油酿造厌氧菌：堆积培养法。——白酒生产2.工业培养液体培养法：好氧菌：浅盘培养：早期青霉素与柠檬酸发酵；深层液体通气培养：大型发酵罐+搅拌。——糖化酶生产厌氧菌：液体静止培养法：液体培养基置于发酵罐中，不通气，不搅拌，静置保温培养，简化了工艺，节约了能源。——啤酒生产大型发酵罐三、微生物生长繁殖的测定方法（一）总细胞计数法（二）活菌计数法微生物生长繁殖测定：个体计数生物量测定评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制或杀死作用的效果；客观地反映微生物生长的规律。（三）重量测定（四）生理指标测定原理：将1cm2×0.1mm的薄层空间划分为400小格，从中均匀分布地选取80或100小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。1.血球计数板法缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察。原理：在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。2.比浊法在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度(opticaldensity,即O.D.)表示菌量。实验测量时应控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确：合适波长；适宜菌液浓度；3.平板计数法对样品进行适当稀释→单个微生物在适宜的平板固体培养基上培养→对肉眼可见的菌落数目计数→推测样品中的微生物细胞数在科研中一般用菌落形成单位（colonyformingunits，CFU）来表示，而不是直接表示为细胞数。样品充分混匀；每支移液管及涂布棒只能接触一个稀释度的菌液；同一稀释度三个以上重复,取平均值；每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数。适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物。测含氮量：原理：蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%。根据一定体积培养液中的含氮量乘以6.25，可测得粗蛋白的含量。“凯氏定氮法”其他方法：含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。4.生理指标法将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来，然后烘干（干燥温度可采用105℃、100℃或80℃）、称重。一般干重为湿重的10%~20%，一个细菌细胞一般重约10-12~10-13g。适合菌浓较高的样品。5.干重法6.湿重法7.涂片染色法8.薄膜过滤计数法第一节微生物生长的研究方法第二节微生物的生长规律第三节环境对微生物生长的影响第四节微生物生长的控制同步培养：能使培养物中所有微生物细胞都处于相同的生长阶段的培养方法。一、微生物的同步生长同步培养物用途：来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性；作为工业发酵的种子。细胞同步生长细胞非同步生长同步生长：在培养物中所有的微生物细胞都处于同一生长阶段。环境诱导法机械筛选法抑制DNA合成温度调整法营养条件调整法离心沉降分离法硝酸纤维素薄膜法代谢抑制剂阻碍DNA合成一段时间，然后解除抑制。氨基蝶呤、5-氟脱氧尿苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷等。硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步生长的方法由于细胞的个体差异，同步生长只能维持2~3个世代，随后又转变为随机生长。二、单细胞微生物的生长曲线生长曲线(GrowthCurve)：细菌接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横座标，以细菌数目为纵座标作图，得到的反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。在微生物学中提到的“生长”，指群体生长。细菌的生长曲线一般用菌数的对数为纵坐标作图一条典型的生长曲线可以分为四个时期：迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期1.迟缓期(Lagphase)将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加或增加很少，生长速度接近于零，也称延迟期、适应期。迟缓期的特点：①生长速度接近于零；②细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞的平均长度比刚接种时长6倍。一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大；③细胞内RNA（尤其是rRNA）含量增高，合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶；④对外界不良条件反应敏感。分裂迟缓、代谢活跃迟缓期出现的原因：微生物接种到一个新的环境，短时间内缺乏分解和催化有关底物的酶，或是缺乏充足的中间代谢产物等。为产生诱导酶或合成中间代谢产物，就需要一段适应期。调整代谢影响延滞期长短的因素：菌种、接种量、培养基在生产实践中缩短迟缓期的常用手段：(1)通过遗传学方法改变种的遗传特性；(2)利用对数生长期的细胞作为种子；(3)接种前后的培养基组分不要相差太大；(4)适当扩大接种量。2.对数期(Logphase)又称指数生长期(Exponentialphase)，紧接着延滞期的一段细胞数以几何级数增长的时期。①以最大的速率生长和分裂，细菌数量呈对数增加；②细菌内各成分按比例有规律地增加，表现为平衡生长，细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较一致；③酶系活跃，代谢旺盛，是研究微生物基本代谢的良好材料；④在生产上常用作种子，使微生物发酵的迟缓期缩短，提高经济效益。指数期的特点：三个重要参数：繁殖代数（n）代时（G）生长速率常数（R）t–t0————=Gn细菌细胞分裂繁殖一代所需的时间为代时(Generationtime)，用G表示。生长速率常数（R）=1/G纳米细菌（nanobacteria），三天才分裂一次；九十年代初期从地下数公里发现的超微型细菌，用代谢产生的CO2作指标，计算出这些超微菌的代谢速率仅为地上正常细菌的10-15，有人认为它们需要100年才能分裂一次。影响微生物代时长短的因素：①菌种：不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同；②营养成分：在营养丰富的培养基中生长代时短；③营养物浓度：一定范围内，生长速率与营养物浓度呈正比；④温度：在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关。3.稳定期(Stationaryphase)又称恒定期或最高生长期，此时培养液中活细菌数最高并维持稳定。稳定期的特点：①细胞的死亡数与新增数接近平衡，总菌数达到最大值，菌体含量最高；②代谢活力钝化，细胞含有较少的核糖体，mRNA的水平低下，RNA和蛋白质合成缓慢，细胞生长变得不平衡。③积累贮存物质，如糖原、异染粒等；也是积累代谢产物的重要阶段，某些抗生素的大量形成也在此时期；④芽孢杆菌在此阶段形成芽孢。稳定期到来的原因：营养物质消耗；营养物的比例失调（如C/N比值不合适）；pH、氧化还原电势等环境变化；有害代谢产物积累（如酸、醇、毒素、H2O2等）。4.衰亡期(Deathphase)营养物质耗尽，有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生速率，整个群体呈现出负增长。衰亡期的特点：①代谢活性降低；②细菌衰老并出现自溶；③产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。④菌体细胞也呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有些革兰氏染色反应阳性菌此时会变成阴性反应。衰亡期到来的原因：外界环境对继续生长越来越不利，引起细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，从而导致菌体衰老与死亡。1.微生物在对数生长期生长速率最快；2.营养物的消耗，代谢产物的积累，以及因此引起培养条件的变化，是限制培养液中微生物快速增殖的主要原因；3.用生活力旺盛的对数生长期细胞接种，可以缩短延迟期，