第三章-吸附层析

第四章吸附层析(Absorptionchromatography)第一节层析技术概述一、原理又叫色层法、色谱法。是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分理化性质的差别，使各组分以不同的程度分布在固定相和流动相中，经连续多次分配、吸附或交换作用，从而使各组分以不同速度移动而达到分离。性质：吸附力；分子形状和大小；分子极性；亲和力；分配系数等。二、产生和沿革：1.产生：1903年，用于植物色素的分离提取。分离后的叶绿素、叶黄素等在碳酸钙的吸附柱上，从上到下排列成色谱，故也叫“色层分离法”或“色谱法”。2.发展：层析基质和仪器的发展层析方法的发展层析操作的发展：简便、快速、自动化三、分类可根据不同角度进行分类：•依固定相（床）的形式分类：柱层析薄板层析薄膜层析纸层析等洗脱液样品填充物分部收集玻璃柱依流动相分类：液相层析和气相层析。依分离原理分类：吸附层析、分配层析、离子交换层、凝胶过滤层析、亲和层析、聚焦层析等。各类层析的原理和载体类别分离原理基质或载体吸附层析化学、物理吸附硅胶、氧化铝、羟基磷酸分配层析两溶剂相中的溶解效应纤维素、硅藻土、硅胶凝胶层析分子筛效应的排阻效应sepharose、sephadex离子交换层析离子基团的交换反应离子交换树脂、纤维素、葡聚糖亲和层析分离物与配体之间有带配基的sepharose特殊亲和力或sephadex聚焦层析等电点和离子交换作用多缓冲交换剂（与带有多种电荷基团的配体相偶联的sepharose6B）四．常用术语固定相：由层析基质组成的。这些基质能与相关的化合物进行可逆的吸附、溶解和交换作用。流动相：在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体称为流动相。柱层析时，称洗脱液或洗涤剂；薄层层析时称展层剂。操作容量：指在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，一般以每克（或毫升）基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数表示。数值大，表明基质对某中成分的结合力强；反之，则小。床体积（Vt）：指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积。床由三部分组成：基质本身、内部孔隙和外部缝隙。基质体积(Vg)：指基质自身所具有的体积。内水体积(Vi)：指基质颗粒内部体积的总和。外水体积(Vo)：指基质颗粒之间（空隙）体积的总和。关系：Vt=Vo+Vi+Vg洗脱体积(Ve)：指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大时的流动相体积。膨胀度（V）：在一定溶液中，单位重量的基质充分膨胀后所占有的体积。一般，亲水基质比疏水性的大。分配系数（K）：指某一组分在固定相与流动相中含量的比值。迁移率（Rf）：指一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移动距离之比值。K与Rf之间的关系：Rf∝1/K，即反比关系。K大，表明该组分与固定相结合力大，迁移率小；反之，亦然。物质间分配系数或迁移率差异程度越大，分离效果越好。第二节吸附柱层析•基本原理固定相:即吸附剂。指凡能将液体或气体中某些物质浓集于其表面的固体物质。可通过静电引力、范德华力与蛋白质、核酸等结合。并且由于各种欲分离物质结构不同，吸附力强弱不同。流动相：一般为液体。可解吸附。不同吸附力的物质解吸附快慢不同。过程：吸附、解吸附、再吸附的连续过程。•简言之：吸附层析主要是利用吸附剂对不同物质吸附力的差异而使混合物分离的方法。二、吸附剂（一）吸附剂的选择①具有较大的吸附表面和一定的吸附能力，对欲分离的物质应有不同的吸附能力，即有较高的分辨率。②与展层剂或洗脱剂及样品中各组分不起化学反应，并不在这些试剂中溶解（化学稳定性高）。③粒度均匀，在柱层析中要有一定的机械强度。（二）吸附剂的预处理：①过筛：除去过大的颗粒；②悬浮法：除去过小的颗粒；③酸碱浸泡、沸水煮、清水洗；④有机溶剂浸泡：除去杂质；⑤热处理活化：使除去或保持一定的含水量，提高分离效果。（三）常见的吸附剂无机的：Al2O3、CaCO3、羟基磷灰石、活性炭、硅胶等有机的：纤维素、蔗糖、淀粉等天然的：滑石、陶土、黏土等硅胶:SiO2·XH2O结构特点：颗粒状、多孔、表面有许多硅醇基团（—Si—OH，功能基团）用途：用于非极性和极性物质的分离。如氨基酸衍生物、甾体激素、皂苷类、类脂、色素等注意事项：①活化，即110℃烘，1h；②立即使用；③干燥器或密闭的瓶可短时间保存；羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）分子式Ca10（PO4）6（OH）2是一种磷酸钙晶体，是骨骼和牙齿的主要成分。可用作骨科、牙科材料、荧光材料、聚合助剂、湿度传感器、催化剂及层析分离介质。吸附原理：在HA晶体表面有两种不同的吸附面（a晶面和b晶面）。a晶面由Ca2+基团构成，带正电荷，可以和生物分子表面的负电荷基团相互反应，起主要作用；b晶面由PO43-基团构成，带负电荷，可以和生物分子表面的正电荷基团相互反应，起次要作用。用途：分离带负电荷的化合物，如蛋白质、核酸、病毒等。三、柱层析系统：包括恒流泵、层析柱、部分收集器、检测器、记录仪五部分组成1.恒流泵：①增加压力:②获得均匀的流速。2.层析柱：材料：国内主要是玻璃层析柱，国外有塑料的。柱大小、粗细多样。柱下有筛板，石英砂烧制，有3#、5#型号，区别在于筛孔大小不同。规格：试验盒规模的为几毫升；实验室规模的为几到几十毫升；生产规模的为几升到十几升。径高比：d：h=1：10～1：40（d直径，h柱高）体积小的选瘦长型的，大的选矮胖型的；颗粒细的选矮胖型的，颗粒粗的选瘦长型的。3.检测器：用于检测流经层析柱的样品。利用蛋白质或核酸的紫外吸收特征、电导率等。4.部分收集器：用来收集层析柱中流出的样品。按时间、体积、质量等不同方法分管收集。5.记录仪：绘制曲线。四、操作•装柱；平衡；•上样；•洗脱和检测；•层析柱的再生；a.将层析柱垂直固定，加入适量溶剂排走空气。b.将平衡好的吸附剂搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至1/4-1/3高时打开下端出口，让溶剂慢慢流出，继续倾入吸附剂至沉降到所需高度。c.用3-5倍柱床体积的起始缓冲液走柱，使吸附剂充分平衡，柱床稳定。装柱、平衡上柱、洗脱、收集a.如图装好层析装置，打开下端出口，使溶液流出至刚好达到吸附剂表面b.沿柱壁缓慢加入2ml样品，打开下端出口，待样品液流到基质表面时，用滴管加入洗脱剂直高出液面5cm。c.打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。d.用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管。绘制曲线以管号或洗脱体积为横坐标，以每管溶液中样品的浓度或活性为纵坐标。曲线用途：表明物质的高峰；确定有利的收集部分。收集范围确定：由原材料和要求的纯度（纯化倍数）来确定。V或管号含量或活力洗脱峰ⅠⅡⅢ吸附剂再生再生：是指用适当的方法处理来恢复原来的性能。不同基质，方法不同。第三节吸附薄层层析一、薄层层析（thinlayerchromatography,TLC）：又叫板状层析。把涂布在玻璃板上或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相来分离小分子化合物的一种层析方法。二、原理：吸附薄层层析、离子交换薄层层析、分配薄层层析等。薄层层析上行下行卧式薄层层析玻璃板固定相流动相三、优点①时间短，分离一般混合物只需15～60min;②设备简单、操作方便，分析、制备都适用；③灵敏度高；④温度、溶剂饱和度对Rf值影响较小；（重复性好）⑤多数可使用腐蚀性显色剂。四、操作及注意事项简介硅胶薄板层析、主要在实验上讲。1.硅胶：薄层层析中颗粒为150～200目（孔/cm2）柱层析中的颗粒为60目。型号：硅胶H：纯硅胶，黏性差，一般用于卧式，耐腐蚀性好，可用腐蚀性显色剂。硅胶G：含10%～15%锻石膏和5%的淀粉，黏性好，不耐腐蚀，上行、下行较好。硅胶CMC：含适量的羧甲基纤维素，黏性好，不耐腐蚀，上行、下行较好。GF254和HF254：分别为含荧光粉的硅胶G和H，分离紫外灯下不发荧光的物质。2.操作（1）铺板要求均匀、厚度1mm，干厚0.25～0.3mm。（2）活化很重要。加温使水分蒸发。110℃1～2h。特别注意：缓慢升、降温。干燥器保存。（3）点样需小，2mm直径。（4）展层选适当的的展层剂，恰当的装置。展层的方式有：上行、下行、连续和卧式。（5）显色计算Rf喷雾显色。要求均匀，防脱落。