Imageproplus使用指南

Imageproplus的主要用途是分析测量图象。1.基本操作2.AOI技巧3.AOI技巧续4.编制宏操作5.计数6.校正标尺7.几何测量8.图象分析策略9.其他有趣的功能10。讨厌的光密度11.免疫组化光密度图片的测量12.免疫组化光密度图片的自动测量13.荧光照片的测量14.双染料染色照片的合成方法打开ipp后的界面是这样的，该从何处下手呢?这张照片中的黄色部分是免疫组化染色的阳性表达成分。处理目标是通过测量图片中黄色部分的黄度来反映相应蛋白表达的的量。对该图片进行观察，可以看到图片中主要有三种主要颜色，一是染成蓝色的细胞核，二是呈现出黄色的胞浆，三是细胞间的空隙区域，呈现出浅蓝色，是为背景。所以首先要把图片中呈现黄色的区域给挑选出来，然后才是测量这些挑出来的区域的各种测量参数，如面积、平均半径、周长、光密度等等。这部分需要挑出来进行测量的区域是我们最感兴趣的地方，叫作AOI(areaofinterest)。AOI是IPP中最有用最重要的概念。然而在选择AOI之前必须转换图象intensity格式。校正光密度单位的操作要在打开第一张图片后立即进行。将光密度单位设定为system之后就不必再对后面的每一张照片都进行光密度校正了。在默认的intensity格式中，是图片灰度，越黑数值越小，越白数值越大。而实际上我们测量的染色强度是光密度，染色越深，光密度值越大。如果不进行光密度单位的转换，测量的数值将完全是错误的。转换光密度单位的方法如下:点击:measure--carliberation--intensity，调出intensity校正窗口。然后在窗口中点new按纽，再点一下下面的stdopticaldensity选项，这时可以看到窗口中的直线变成了反向的曲线。然后还要点一下最上面的system按纽。最后点close关闭窗口。这样就把程序系统的灰度单位转换成了光密度单位。然后就是如何能够准确地选取AOI就是使用IPP的关键操作。一旦准确地选取了AOI，下面的测量分析就好办了。在其他的测量软件中，选择这种不规则的区域一般只能用手拖着鼠标来画，而在IPP程序里，可以通过设置颜色范围让电脑来帮助你选择这些不规则区域，这样的选择就准确多了。可以说，使用IPP的要点就是灵活地使用各种AOI工具准确地把那些需要测量的区域给挑选出来。对不同的图片，需灵活地使用各种适当的AOI工具，先用最简单的，当然，简单的工具只能作简单的事，就这张图片来说，用简单工具选黄色有点困难，我们先用它来选择蓝色的细胞核吧。点击measure---count/size,弹出分类测量窗口。在窗口中选中manual,再点击selectcolor,弹出颜色选择窗口segmentation,这个工具是IPP最有特色的颜色选取工具之一。用好这个工具是使用IPP的要点。对于目标颜色鲜明的图片，用吸管工具是最简单的。点一下吸管图标，在目标区域点一下，就可以选中该点的颜色，当然一下是不可能完全选中所需要指定的全部区域，可以在未选中的地方接着再点，这样多次选取，直到把想选中的区域全部选中为止。在这张示例图中，选中的蓝色细胞核部分被标上了红色。用红框圈起来的四个工具按纽分别是:吸管、撒消上一步操作、橡皮擦、全部清除。下在的小方框里则是吸管位置的选取颜色。图片中被标上红色的区域被定义为一个class,其中每一个独立的小区块被定义为这个class中的一个object。以此图为例，图中深蓝色的部分是细胞核，因此所有的细胞核都被选中成一个class，其中每一个细胞核就是一个object。选取完AOI后，点击close回到count/size窗口，下一步就可以对选中的object进行测量操作了。点击count/size窗口中的measure菜单，点selectmeasure，这是选择要进行何种测量操作，在弹出的测量选择窗口左侧列出了各种可用的测量选项，最常用的测量有:area面积、density(mean)平均光密度、diameter直径、IOD(integratedopticaldensity)累积光密度。在相应的项目上点一下，该测量项目就被选到中间的窗口中了，同时关于该测量的详细说明会显示在最右边。如果想取消某个已选中的测量项目，则在左边窗口中该项目上再点击一下就可以了。选好了待测量的区域，也指定了测量项目，就可以进行测量统计了，点击一下测量选择窗口的OK纽，关闭这个窗口，就回到了count/size窗口，再点击一下count按纽，就可以看到程序在进行测量，稍等几秒钟即可读取测量数据。分别点击count/size窗口中view菜单中的measurementdata和statistics，就分别弹出这两个数据窗口。前者是这个calss中每一个object的测量数据，后者是这些测量数据的统计参数，如总数、平均值、累加、标准差等。本例中得到的就是每个细胞核的面积、平均光密度值、直径、累积光密度值。统计数据则可得到这张图片中所有细胞核的平均面积、平均光密度值，平均直径、累积光密度值，当然还有细胞核的数目，就是所有object的数目。测量数据转入EXCEL处理起来最方便。只要在数据菜单中点file-DDEtoEXCEL。数据就传到EXCEL的sheet1里去了。在这个示例图片的统计数据中samples为图中所有细胞核的个数。第一列为area,其中的Mean值为各个核的平均面积，后面就是平均灰度、平均直径，这些是有意义的测量统计数值。但IOD却是SUM值更有意义。AOI技巧在IPP中，最有特色，最有用处的工具有两个。一个就是我们已经看过的segmentation工具，另一个是irregular工具。我们先看irregular工具。这是一个用来描绘不规则孤立对象边界的工具。图中一个个棕黄色形状是免疫组化染色的贴壁培养细胞，为了计算每个细胞的面积及蛋白表达，首先就是要选取每个细胞的边界线。这就可以用到irregular工具了。在工具栏上点一下那个不规则园形的按纽，就调出了irregular工具条。这个工具的标题叫Magicwand，就是photoshop中的魔棒呀。将鼠标移至图中一个细胞的中间，光标就变成魔棒了，在一个位置左键点一下，就选中了这个位置及其周围灰度相似的区域。这里相似的定量范围由Range的值来决定。较大的值为较大的灰度范围，点一下能选中一大片区域。较小的range值则为较小的灰度范围。在一个区域上多点几下，就能选中这个区域的整个边界了。最后点一下右键，就确定了一个不规则形状的选定区域。点一下左边的问号，就能看到相应的使用说明。smooth值是用来平滑区域边界的。一般不需要平滑，因此默认值为零。选中一个区域后如果还要在同一张图片上再选另一个区域（最后点一次右键），不能直接点选，要先点击一下工具栏上的MultipleAOI按纽，再点击add，接下去就可以到另一个选择区域点选。选好一个新的区域后再回去点MultipleAOI--add确认，再继续下一个，直到选取完所有的AOI。最后在图片上任一处点一下右键结束选择操作。结束后如果又想再增加选择区域，只要再点一下newAOI按纽，就可以调出工具条继续增加选择区域。这个irregular工具还有另一个操作方式，在问号旁边有个trace按纽，点一下它，工具条就变成另一个样子了。这种操作方式是沿着孤立图像的边缘寻迹，从而画出一个沿着孤立形状边缘围成的一个AOI。第一种是手画法。确认工具条右边的Auto选项没有打勾，将光标移至目标图形处按住左键拖出一个闭合图形，点右键结束。用鼠标画当然是不会准确的。实在没别的招了才会出此下策。第二种方法是自动寻迹。把那个Auto给选上，speed值给减到1(慢速看得清楚)，在目标图形的边缘处左键点一下鼠标，然后沿着边缘稍移动一下鼠标后再点击一下左键，这是给程序指明一个寻迹的方向，马上就能看到光标自动沿着边界走起来了，一直会走到起点处才会停止。这样就自动围成了一个闭合区域，点一下右键就确认了这个AOI。重复选取多个AOI的方法与楼上一样。如果目标图形边界清晰，那么这个工具是非常管用的。可惜的是在许多情况下边界是模糊不清的，光标走到此处时会乱走一气。这时就要及时先点一下鼠标使光标暂停下来，然后在期望的方向延长再点一下左键，给程序指明一下前进的方向，如此多次，直到光标回到起点为止。最后点一下右键围成一个闭合的AOI。围好的AOI边界是绿色框。自动寻迹挺好玩吧?不过别忘了我们的目的。选好了一个个的AOI后当然是要测量每个区域的几何尺寸及光密度啦。下面该怎么作呢?点开count/size窗口，点菜单EDIT---convertAOItoObjects.这样就把刚才选中的一个个AOI变成了要测量的object了，那些小区域的颜色也由AOI绿色外框线变成了object的标记了。object的标记类型是可以自己设定的。在count/size窗口右边有一个option按纽，点开它就能设定object标记的外观了。在option窗口中，outlinestyle可以选outline(轮廓线)或filled(填充class颜色)。labelstyle可以选择为object序号或测量值。再下面是label的文字颜色。右上角还有一个class的颜色选择按纽。。下一步是点measure菜单下的selectmeasurements。选上要测量的项目。注意，选完后要点击这个菜单中的measure按纽(而不是count/size窗口中的count按纽)。然后是OK按纽关闭measure窗口，点开view菜单下的measurementdate和statistics数据窗口。几个object的测量数据就已经在里面了。如果你还想继续增加objcet，可以直接用irregular工具画AOI，然后点convertAOItoobject。这期间把数据窗口留着不关闭，可以看到新增的object测量数据会立即被更新。在上一主题中讨论的主要是irregular工具，它对于大个的孤立图形对象的选取是有用的。而面对组织切片中密密麻麻的细胞，就得用本主题讨论的segmentation工具了。实际上，在第一部分入门中所用的就是segmentation工具，在那里我用颜色吸管选取了图片中蓝色的细胞核，但是如果仔细观察一下选取的效果就会发现，有一些挨在一起的两个以上的细胞核被识别成了一个，另有一些蓝色的杂质颗粒被错误地识别成了细胞核。如果你试着用吸管工具选取一下图中黄色的免疫反应表达区域，就会发现因为黄色很浅，很不容易准确地选取。所以对于segmentation工具还需要有更多的应用技巧。让我们还是从打开图片并调出count/size窗口开始吧。对这种色彩饱和度低，各种成分颜色区别很小的图片来说，用吸管是很难准确选择到正确的颜色区域的。在count/size窗口里选中manual，并点selectcolor调出segmentation窗口。窗口里有两个表单，一个是colorcubebased，另一个是histogrambased。如果你测量的对象颜色单一，色彩对比大，则使用colorcubebased中的吸管就可以方便地选择到需测量的区域。而对于那些有颜色深浅及亮度不同的测量区域，我们要选取后者，并且使用HSI颜色格式来进行分色选择。当切换到HSI时，会弹出一个窗口提示你会reset颜色选择，是否继续?当然是OK啦。这时的颜色选择全部重置为0-255。在HSI颜色格式中，H为色调，就是我们眼睛所看到的红橙黄绿青蓝紫等。S为色饱和度，I为强度。在选择AOI时，首先保持S、I为最大范围，从H中选择黄色部分。使用这个颜色格式的好处是，选择的颜色能包括这种颜色的不同深浅及亮度。最适合于测量免疫组化图片。点一下H，直方图显示就是图片各象素H值的分布，在直方图的两边各有一根线，这就是选择线，先将右边的线用鼠标左键向里面拉，拉一点停一下看看效果，可以看到最开始时是选中了全部画面，然后是蓝色的区域慢慢显露出来，并且越显越多，选择线的位置也在下面的窗口中有显示，是0-255之间的数，共