小麦生理参数测定方法

叶绿素含量测定原理叶绿素约占总干重的1%，含a、b、c、d四种，高等植物含a、b两种，光、温度、营养元素氧、水是叶绿素合成的重要环境因子。叶绿素是双羧酸酯，不溶于水，通常用含少量水的有机溶剂如80%的丙酮或95%的乙醇来提取叶片中的叶绿素，这是因为叶绿素与蛋白质结合很牢固，需要经过水解作用才可被提取出来。已知叶绿素a、b的95%乙醇提取液最大吸收峰的波长分别为665nm和649nm，用95％乙醇研磨法和浸泡法提取叶绿素，以提取试剂95％乙醇为对照,用分光光度计分别测定649nm、665nm处的吸光度并计算叶绿素浓度，计算公式为：Ca＝13.95D665－6.88D649；Cb＝24.96D649－7.32D665；CT＝Ca＋Cb(注：Ca：叶绿素a的含量；Cb：叶绿素b的含量；CT：总叶绿素的含量)仪器：研钵、25mL容量瓶、漏斗、剪刀、滤纸、722光栅分光光度计、具塞试管试剂：95%乙醇（AR）丙酮（AR）1:1、碳酸钙（AR）、石英砂（AR）实验方法称取小麦叶片0.2g剪碎置于研钵中，加少许CaCO3，石英砂、95%乙醇充分研磨，过滤，将滤液移入25mL容量瓶，用95%乙醇（AR）丙酮（AR）1:1反复洗涤残渣、滤纸至无绿色，合并滤液，定容。取上述提取液1mL稀释至10mL，摇匀。以95%乙醇为参照，在分光光度计665nm/649nm下测其光密度。Chla含量（mg/g）=(13.95D665－6.88D649)V/(W1000)Chlb含量（mg/g）=（24.96D649－7.32D665）V/(W1000)式中：A--测定波长下的光密度值V--叶绿素提取液总体积（mL）（若用的稀释液，则应乘以稀释倍数）W—材料鲜重（g）含量：mg/g=（浓度*提取体积*稀释倍数）/样品鲜重（植物生理学实验指导李玲）参考文献《化学生态学实验指导书》-王晗光编写SOD的测定原理：SOD可催化下列反应：仪器：高速冷冻台式离心机；分光光度计；移液器；光照培养箱；指形管；研钵试剂：1.50mmol/L磷酸缓冲液(pH7．8)2.130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液：称取1.9339gMet用磷酸缓冲液溶解定容至100mL3.750/LNBT（氮蓝四唑）溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液溶解定容至100mL，避光保存4.20L核黄素溶液：称取0．0750g核黄素用磷酸缓冲液溶解定容至l00mL，吸取1mL定容至100mL即可，随用随配，避光保存5.100mol/LEDTA-Na2溶液：称取0．0372gEDTA-Na2·2H20，用磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，吸取10mL定容至100mL即可。6.SOD提取介质：50mmol/L磷酸缓冲液(pH7．8)内含1％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。(材料)正常生长或经逆境处理的植物组织器官实验方法：1.取小麦叶片(去叶脉)0.5g于预冷的研钵中，加1mL磷酸缓冲液在冰浴下研磨成匀浆，倒入10mL刻度试管中，加缓冲液定容为5mL。取2mL于离心管离心20min，上清液即为SOD粗提液。2.每个样品取8个洁净干燥的微烧杯(透明度好)编号，按表加入各试剂，反应系统总体积为3mL。其中4～8号管中磷酸缓冲液和酶液的加入量依样品中的酶活性进行调整，如果酶活性强时，可适当减少酶液用量。试剂全部加入后混匀，将1号杯置于暗处，其余各杯均于25℃、4000lx日光灯下反应20min，各管受光情况要一致。温度高时，时间缩短；温度低时，时间延长，然后立即遮光停止反应。反应系统中各试剂用量在560nm波长下，以1号杯调零，测定其余各杯反应体系的吸光度。以2、3号杯吸光度的平均值作为还原率的100％，分别计算不同酶液量抑制NBT光还原的相对百分率。以酶液用量(pL)为横坐标，以NBT光化还原的抑制率(％)为纵坐标绘制二者相关曲线，NBT光化还原被抑制50％的酶液量为一个酶活单位。SOD总活性[u/g]=SCKTEWVAVA5.0)A(CKSOD比活性[u/mg]=蛋白质含量总活性SODCKA：照光对照管的吸光度EA：样品管的吸光度TV：样品液总体积（ml）W：样品鲜重（g）SV：测定时样品用量（g）参考文献《植物生理学实验教程》-张立军，樊金娟主编2007《基础生物学实验教程》-王德良，周小慧主编2006POD的测定原理：过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系。在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化。因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质。该物质在470nm处有最大吸收，可用分光光度计测量470nm处的吸光度变化速率来测定过氧化物酶的活性。仪器：研钵，恒温水浴锅，25mL容量瓶，吸管，高速冷冻离心机，秒表，磁力搅拌器试剂：1.愈创木酚2.30％过氧化氢。3.100mmol／L，磷酸缓冲液(pH6.0)4.反应混合液：取100mmol／L磷酸缓冲液(pH6.0)50mL于烧杯中，加入愈创木酚28，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚完全溶解，待溶液冷却后，加入30％过氧化氢19L，混合均匀，保存于冰箱中备用实验方法：1.称取新鲜小麦叶片0.1g，剪碎，放入预冷的研钵中，加入适量预冷的磷酸缓冲液冰浴研磨成匀浆。残渣再用5mL磷酸缓冲液提取一次，合并两次匀浆液，以4000rpm低温离心15min，上清液即为粗酶液，定容至25mL，酶液贮于低温下备用。2.取2支试管，于1支中加入反应混合液3mL。和磷酸缓冲液1mL，作为对照，另1支中加入反应混合液3mL，和上述酶液1mL。(如酶活性过高可稀释之)。迅速将两支试管中溶液混匀后，倒人比色杯，置于分光光度计样品室内，立即开启秒表记录时间，于470nm处测定吸光度(OD)值，每隔30s读数一次。3.以每分钟OD变化值[470／(gFw·min)]表示酶活性大小，也可以用每分钟OD值变化0.01作为1个过氧化物酶活性单位(U)表示。过氧化物酶活性[U／(gFw·min)]=470*式中:470--反应时间内OD变化值VT--提取酶液总体积(mL)W--植物鲜重(g)Vs--测定时取用酶液体积(mL)t--反应时间(min)参考文献：《植物生物学实验》-常福辰，陆长梅，沙莎主编2007《植物生理学实验技术》-张治安，陈展宇主编2008《植物生理学实验技术》-孔祥生，易现峰主编2008CAT的测定（紫外吸收法）原理H2O2对240nm波长的紫外光具有强吸收作用，过氧化氢酶(CAT)能催化H2O2分解成H2O和O2，因此在反应体系中加入CAT时会使反应液的吸光度(A240)随反应时间降低，根据A240的变化速率可计算出CAT的活性。仪器：紫外分光光度计、恒温水浴、冷冻离心机、电子天平、100mL移液枪2支、10mL试管4支、5mL、2mL、lmL移液管各1支、25mL容量瓶、10mL具塞试管、剪刀、研钵试剂：1.150mmol/L磷酸缓冲液(pH7.8)（内含1%PVP）2.100mmol/LH2O2溶液（取30%H2O22.8mL用磷酸缓冲液定容到250mL，现配现用避光保持）实验方法1.酶液提取称剪碎混匀的小麦叶片1.00g置于预冷的研钵中，加适量磷酸缓冲液及少量石英砂，在冰浴上研磨匀浆，转移至25mL容量瓶中，用磷酸缓冲液冲洗研钵2—3次(每次l一2mL)，合并冲洗液于容量瓶中，定容至25mL，摇匀。取提取液5mL于离心管中，在4℃、15000rgm下离心15min，上清液即为酶提取液，4℃下保存备用。2.CAT活性的测定①取10mL具塞试管，加2mL酶提取液于沸水浴中加热煮致失活，冷却备用②取10mL试管4支，3支为测定(3个重复)，1支为对照，按下表加入试剂。③将上述4支试管于25℃水浴中预热3min后，逐管加入0.2mL100mmol/LH2O2溶液，每加一管立即在紫外分光光度上测定A240(蒸馏水调零)，每隔30s读数一次，共测4min，记录4支试管的测定值。3.结果计算以lmin内A240降低0.1(3支测定管的平均值)为一个酶活性单位(U)，先求出3支测定管各自每分钟A240降低值，按下式汁算CAT活性CAT活性（U·g-1FW·min-1）=式中：=A一A为对照管吸光度；AS1、AS2、AS3为样品测定管与对照管吸光度的差值FW：样品鲜重(g)；Vt：酶提取液总体积(mL)VS：测定用酶液量(mi。)t：测定时间(min)。参考文献：《植物生理学研究技术》-孙群等编著2005《植物生理学实验指导》-高俊凤主编2006丙二醛的测定原理植物器官在逆境条件下或衰老时，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是其产物之一，通常将其作为脂质过氧化指标，用于表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。在酸性和高温的条件下，丙二醛可与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的3，5，5一三甲基嗯唑一2，4一二酮，在532nm处有最大吸收波长。但该反应会受到可溶性糖的极大干扰，糖与TBA的反应产物在532nm处也有吸收，但其最大吸收波长在450nm处。植物在经受逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定中需排除可溶性糖的干扰，通常加入低浓度Fe3+(使其终浓度为0．5nmol／L，植物组织中铁的含量一般为100～300g／g干重)，以显著增加TBA与糖的显色反应产物在450nm处的吸收。采用双组分分光光度法可分别求出MDA和可溶性糖的含量。该法针对混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽有明显的差异，但吸收曲线彼此又有些重叠，可根据Lambert—Beer定律，通过代数方法，计算出一种组分由于另一种组分存在时对OD值的影响，最后分别得到两种组分的含量。仪器：实验仪器分光光度计，离心机，研磨器，恒温水浴，具塞试管试剂：三氯乙酸，石英砂，硫代巴比妥酸(TBA)溶液(用10％TCA配制0．6％的TBA溶液，称0.6gTBA，定容100ml)实验方法：1.小麦在抽穗期停止浇水，进行干旱处理，取叶片1g将其剪碎，加入10%三氯乙酸(TCA)2mL和少量石英砂，研磨；进一步加入8mLTCA充分研磨，匀浆液以4000g离心10min，上清液即为样品提取液2.显色反应及测定吸取2mL提取液，加入2mL0.6％TBA液，混匀，在试管上加盖塞，置于沸水浴中沸煮10—15min（不得超过此时间）迅速冷却，离心。取上清液测定532nm和450nm，600nm处的OD值。对照管以2mL水代替提取液。3.计算MDA与TBA反应产物的最大吸收峰在532nm，TBA与可溶性糖(以蔗糖为例)的反应产物的最大吸收峰在450nm，吸收曲线彼此又有重叠(下图)。根据Lambert—Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与OD值A有如下关系：A1=Caa1+Cbb1(1)A2=Caa2+Cbb1(2)式中：A1为组分a和组分b在波长1时OD值之和；A2为组分a和组分b在波长2时OD值之和Ca为组分a的浓度，单位为μmol/L；Cb为组分b的浓度，单位为μmol/La1、b1分别为a、b在1时的摩尔吸收系数；a2、b2分别为a、b在2时的摩尔吸收系数已知蔗糖与TBA反应产物在450nm和532nm的摩尔吸收系数分别为85.40、7.40；MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下无吸收，吸收系数为0.于532nm波长下的摩尔吸收系数为155000,根据（1）、（2）可得：求解方程得：式中：Ca为蔗糖与TAB反应的浓度，单位是μmol/LCb为MDA与TAB反应的浓度，单位是μmol/L根据上面公式即可计算样品提取液中MDA的含量，然后再计算每克样品中MDA的含量注意：要求分光光度计的准确MDA浓度=6.45*（A532-A600）-0.56*A450MDA含量（μmol/g）=WVVCVT211000C:MDA浓度(μmol/L)VT:样品提取液的总体积（ml）V1:样品提取液和TBA溶液总反应液体积（ml）V2:与TBA反应的样品提取液体