巢式PCR引物的设计

巢式PCR中的引物设计实例ByHXPartI外引物设计PartII内引物设计（以JNK2α1为例设计）外引物的设计（软件设计）打开“PrimerPremier5——File——New——DNAsequence，粘贴mRNA的序列”后出现如下的图，选择“AsIs”点“OK”。Part I点“OK”完后出现如下的图，点“Primer”Part I点“Primer”完后出现如下的图，点“Search”Part I点“Search”完后出现如下的图以JNK2α1mRNA为例：mRNA----4682bpCDS------1146bpCDS------274to1419，参数设置完后点“OK”Part I±点“OK”完后出现下图说明搜索完毕，接着点“OK”Part I此图即是外引物设计的结果，点击右边提示框中的引物对即能出现关于引物的详细信息Part IHairspin:引物自身配对Dimer：两个相同引物（正义或反义）结合FalsePriming：引物结合cDNA位置错误（错配）CrossDimer：两个不同引物（正义与反义）结合内引物上游引物的设计（人工设计）打开“PrimerPremier5——File——New——DNAsequence——粘贴CDS开头30个左右碱基的序列”后出现如下的图，选择“AsIs”点“OK”。Part II点“OK”完后出现如下的图，点“Primer”Part II点“Primer”完后出现如下的图，选中“S（ense）”后点“EditPrimers”Part II点“EditPrimers”后出现下图，在框选处从右向左删碱基，点“Analyze”分析。Part II此图即是内引物上游引物设计的结果。Part IIHairspin:引物自身配对Dimer：两个相同引物（正义或反义）结合FalsePriming：引物结合cDNA位置错误（错配）CrossDimer：两个不同引物（正义与反义）结合内引物下游引物的设计（人工设计）打开“PrimerPremier5——File——New——DNAsequence——粘贴CDS末尾30个左右碱基的序列”后出现如下的图，选择“Reversed”点“OK”。Part II点“OK”完后出现如下的图，点“Primer”Part II点“Primer”完后出现如下的图，选中“A（nti-sense）”后点“EditPrimers”Part II点“EditPrimers”后出现下图，在框选处从右向左删碱基，点“Analyze”分析。Part II此图即是内引物下游引物设计的结果。由于设计之前将模板序列逆序，所以此处下游引物显示结果也是逆序，在输出时应注意，判断原则：上游引物与模板开头序列一样，下游引物与模板末尾序列互补。内引物设计完加酶切序列（可选）。Part II