医学分子生物学新技术应用

申志发E-mail：[e-mail]：15868772693662693（短号）温州医科大学检验医学院/生命科学院教育部检验医学重点实验室1.代谢组学及研究技术2.microRNA的研究及应用3.免疫共沉淀技术（Co-Immunoprecipitation）4.胞内RNA分子可视技术什么是代谢组学？代谢组学研究方法代谢组学分析技术气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）毛细管电泳-质谱联用技术（CE-MS）核磁共振技术（NMR）生物体系（细胞、组织或生物体）代谢产物发生变化（种类，随时间变化）特定基因突变环境变化生物体系代谢组学研究对象体内各种物质代谢过程互相联系形成一个整体糖类脂类蛋白质水无机盐维生素各种物质代谢之间互有联系，相互依存。消化吸收中间代谢废物排泄机体物质代谢不断受到精细调节机体有精细的调节机制，调节代谢的强度、方向和速度内外环境的变化对机体代谢造成影响适应环境的变化精细的调节控制代谢组(metabolome)是指一个细胞、组织或器官中所有代谢物的集合,包含一系列不同化学型的分子,比如肽、碳水化合物、脂类、核酸以及异源物质的催化产物等。代谢组学(metabonomics／metabolomics)来源于代谢组一词,是研究一个细胞、组织或器官中所有小分子代谢组分集合的科学。代谢组学研究的目的是定量分析一个生物系统内所有代谢物的含量。代谢组学分析可以指示细胞、组织或器官的生化状态,协助阐释新基因或未知功能基因的功能,并且可以揭示生物各代谢网络间的关联性,帮助人们更系统地认识生物体。进行代谢组学研究涉及生命科学、分析科学以及化学统计学三大方面的专业知识。代谢物化学分析技术及数据分析技术的发展极大促进了诸多生物、医学问题的研究,这些知识的综合运用使得代谢组研究在疾病诊断、药理研究以及临床前毒理等研究中发挥了极为重要的作用。代谢组学：通过考察生物体系（细胞、组织或生物体）受刺激或扰动后（如将某个特定的基因变异或环境变化后），其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系的一门科学。研究对象：相对分子质量小于1000的内源性小分子。代谢物小分子类别：多肽、氨基酸及其衍生物、胺、脂类、金属离子。1.关注于内源性小分子化合物。2.对生物体系中的小分子化合物进行定性定量研究3.内源性小分子化合物的上调和下调指示了与疾病、毒性、基因修饰或环境因子的影响。4.内源性化合物的特点用来表征疾病和药物筛选。198219831984198919992000200120022007VanDeGreef:publicationofMSforurineprofilingSadler,BuckinghamandNicholson:Firstpublicationon1H-NMRofbloodandplasmaNicholson,etal.:Multi-componentanalysisofspectradatafromraturineNicholsonandWilson:NMRspectroscopyofbiofluidsNicholson:DefinitionofMetabonomicsHaselden,etal.:FirstindependentPharmapublicationofMetabonomicsNicholson,Lindon,andHolmes:PublicationinNatureonMetabonomicsHolmesandAnttiExplanationofstatisticsinMetabonomicsIncreasing#ofpublications研究步骤：ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics样品采集和制备数据采集：GC/MS,GC-GC/TOFMS,LC-MS,UPLC-Q-TOF,LC-LC-MS,FT-ICR-MS,NMR,FTIR数据处理和分析（峰检测，去噪音，峰匹配，统计分析与识别），主要用到软件：PCA，PLS-DA，ANN靶标识别：运用TOFMS，FT-ICR-MS,MS/MS,NMR数据库检索，标准物对照。可用数据库：KEGG，HumanCyc，ARM，METLIN生物代谢分析生物组织，体液经灭活预处理多个方法联用药物研发疾病研究植物代谢组学微生物代谢组学中药现代化连接图数据库ConnectionsMapDB京都基因与基因组百科全书KEGG()生物化学途径ExPASy互联网主要代谢途径mainmetabolicpathwaysonInternert,MMPDuke博士植物化学和民族植物学数据库Arizona大学天然数据库Wiley_handbookofgc-ms新药及其代谢产物质谱库“肿瘤”代谢组数据库质谱数据库一些有用的数据库：气相色谱-质谱联用技术（GC-MS)液相色谱-质谱联用技术（LC-MS)毛细管电泳-质谱联用技术（CE-MS)核磁共振技术（NMR）1.气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）工作原理：气相色谱仪接口质谱仪常压高真空离子源质量分析器检测器质谱仪的基本结构及工作流程全二维气相色谱质谱技术（GC×GC-TOFMS）气化室检测器色谱柱1色谱柱2调制器用LecoChromaTOFsoftware得到的质荷比为73（m/z）的离子碎片典型GC×GC-TOFMS二维血浆色谱图（AnalyticaChimicaActa，2009，633，257-262）大连化物所许国旺教授分析确定5种糖尿病病源标记物：葡萄糖、2-羟基异丁酸、亚麻油酸、软脂酸、磷酸。脂肪酸代谢紊乱GC-MS适用于挥发性的代谢物。对于非挥发性代谢物的分析需要经过化学衍生。多用于环境分析、大气有毒气体分析、某些疾病诊断等。2.液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）LC工作原理：4000QTrapLC/MS/MS使用PLS-DA处理代谢数据正常组和慢性乙肝组对照（JournalofProteomeResearch,2006,5,554-561）新型超高液相色谱仪HPLC色谱柱填料颗粒：3、5μmUPLC色谱柱填料颗粒：1.7μm分离能力得到空前提高比较（a）HPLC和（b）UPLC用于美沙芬的代谢物TOP质谱全扫描（RapidCommunMassSpectrom,2005,19,843）UPLC相对于传统的HPLC有更好的分离效率、峰容量、及灵敏度，提供更适合与质谱联用的接口，有助于检出更多的代谢物。提高方法通量、灵敏度，改善与质谱联用的定性定量结果。UPLC与质谱联用为代谢组学研究提供更加高效、灵敏的研究平台。代谢组学研究的生物样品中包含多种离子性代谢物（糖酵解代谢产物、三羧酸循环代谢物、如羧酸、磷酸化糖；以及核苷酸、氨基酸、辅酶等代谢物。）毛细管电泳是以毛细管为分离通道、采用高压直流电场为驱动力的的新型液相分离技术，通过离子化合物的质荷比（m/z）不同造成迁移速率不同来实现分离。适用于普通反相色谱柱不易保留的离子性代谢物的分离分析。毛细管电泳-质谱联用分析仪（兰州理工大学）型号：P/ACEMDQ-DecaXPplus厂家：美国BeckanCoulter-Finnigan基于具有自旋性质的原子核在核外磁场的作用下，吸收射频辐射而产生的能级跃迁谱学，主要用于反映化合物结构中的H和C原子的位置信息。1H-NMR：在排除杂质及水峰的干扰下，1H-NMR的谱峰与样品中的化合物的氢原子是一一对应的。所测的样品中的每一个氢在谱图中都有唯一的谱峰与之相对应。图谱中信号的强弱则反映出样品中各组分相对含量的关系，适用于研究代谢产物。电子云：基于具有自旋性质的原子核在核外磁场的作用下，吸收射频辐射而产生的能级跃迁谱学。主要用于反应化合物结构中的H和C原子的位置信息。hr-MASofbiologicaltissue相同强度LipidCH2-COLipidCH2-C=CLipidCH2-CH2-COLipidCH2LipidCH30.81.21.62.02.42.83.2(ppm)CitrateLactateAlanine放大＊１０人前列腺组织（prostatetissu）良性vs.恶性癌症组织给出更多的脂类物含量（lipid）！！！代谢组学研究一般包括四个步骤：第一步，给予生物体一定的刺激。第二步，代谢组数据的采集。用核磁共振、质谱、色谱等分析手段测定其中代谢物的种类、含量和状态以及其变化。第三步，建立表征代谢特征的时空模型。在代谢组学中最常用的建模方法是主成分分析(PrincipleComponentsAnalysis,PCA)。第四步，建立代谢物时空变化与生物体特性的关系，达到从不同层次和水平上阐述生物体对相应刺激的响应的目的。35microRNA的研究与应用10.1.1概述10.1.2.microRNA的分子生物学研究方法10.1.3microRNA的实验技术10.1.4microRNA与疾病36内容结构37概述miRNA是由21~25个核苷酸组成的非编码RNA；•它通过与靶基因的3-UTR的配对，促进mRNA的降解或抑制mRNA的翻译从而抑制其靶基因的表达；•它在生物体生长发育、细胞增殖、分化、凋亡以及人类各种疾病的发生发展过程中发挥重要的调控作用。?什么是miRNA？38概述·MicroRNA的发现•lin-4:Lee等人于1993年在线虫中通过胚胎发育时间控制缺陷性遗传筛选实验中发现，是第一个被发现的miRNA。lin-4在L1,L2阶段大量表达，如缺失，则导致幼虫发育停顿。L1L2L3L4L1~L4，线虫发育的四个不同阶段39•let-7:Rinhart等人于2000年在线虫发现第二个miRNA，let-7。let-7在L3,L4阶段大量表达，控制幼虫的L4阶段向成虫阶段发育转换。L1~L4，线虫发育的四个不同阶段L1L2L3L4概述·MicroRNA的发现1.miRNA基因被转录成pri-miRNA(RNA聚合酶Ⅱ)；2.pri-miRNA被剪切成具有70-100个核苷酸的pre-miRNA(Drosha,DGCR8)；3.pre-miRNA从核内被转移至胞质(Exportin-5,Ran-GTP)；4.pre-miRNA被剪切成21-25个核苷酸的双链RNA双体(Dicer,TRBP,PACT)；5.双链RNA双体中成熟miRNA链会选择性整合入RISC,并与mRNA互补配对。4041MicroRNA的起源与生物合成过程microRNAgenePolⅡ①②Drosha/DGCR8Pri-miRNAPre-miRNACytoplasm③④Dicer/TRBP/PACTduplexintermediate⑤RISCmaturemiRNAmiRNAbiogenesisNucleusExportin-5/Ran-GTP42miRNA与siRNA的性质比较miRNAsiRNA相同点长度及特征分子量约22nt，5'端是磷酸基，3'端是羟基合成的底物均由双链RNA或RNA前体加工而来Dicer酶依赖Dicer酶并具有Dicer加工产物的特征Argonaute家族蛋白均需Argonaute家族蛋白参与RISC均为RISC组分，在介导沉默机制上有相似之处作用方式均可抑制靶基因翻译或导致mRNA降解进化关系两种假设：siRNA是miRNA的补充；miRNA在进化过程中替代了siRNA引自方福德,microRNA的研究方法与应用,中国协和医科大学出版社,200843miRNAsiRNA不同点机制性质是生物体