动物胚胎工程yyd胚胎肝细胞

胚胎干细胞•干细胞的基本概念•胚胎干细胞系的建立•鉴定•定向诱导分化•胚胎干细胞的应用•最新进展和存在的问题一、干细胞（stemcell）的基本概念1、定义：具有自我复制的能力，在一定条件下能够分化成各种功能细胞。2、分类：（1）全能干细胞，包括：胚胎干细胞（embryonicstemcells,ES细胞），生殖干细胞（embryonicgermcells,EG细胞）具有全能性，能够分化成全身200多种细胞类型，进一步形成机体的任何组织和器官。（2）多能干细胞：具有分化成多种细胞和组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力。（3）专能干细胞：只能向一种或密切相关的两种类型的细胞分化。根据来源不同可分为：™1）胚胎干细胞(embryonicstemcell,ES):是由哺乳动物早期胚胎内细胞团分离的，经外抑制分化培养后，所获得的具有保持未分化的状态和无限增殖能力的细胞系。™2）成体干细胞（adultstemcell）:存在各组织器官的未分化细胞，在体内具有终生自我更新能力和分化潜能。如造血干细胞、骨髓基质干细胞、表皮干细胞等。1.衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞；2.永生化(immortal)；3.能维持稳定的正常的二倍体染色体结构；4.有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化；5.能参与胎儿所有组织的发育过程。胚胎干细胞的性质二、胚胎干细胞系的建立1981年，Evans和Martin分别成功的分离和体外培养了小鼠的胚胎干细胞分离囊胚的内细胞群与成纤维细胞共培养，ES细胞非分化增殖-Æ胚胎干细胞的鉴定-Æ定向诱导分化-Æ成体干细胞-Æ功能细胞（一）饲养层细胞的制备™胚胎干细胞培养过程中的关键是维持胚胎干细胞的未分化状态。目前采用的胚胎干细胞培养体系总体上可分为三种，即饲养层培养体系、无饲养层培养体系和无血清培养体系，其中最常见的是饲养层细胞培养体系。™饲养层细胞的作用：1.向培养液中分泌多种细胞因子，提供胚胎干细胞生长的环境和信号；2.通过细胞接触机制和非接触机制促进胚胎干细胞增殖并阻止其分化。™饲养层细胞来源：小鼠成纤维细胞株（STO）、小鼠原代成纤维细胞（PMEF）、同源动物胎儿成纤维细胞、3T3细胞、OP9细胞、胎肝成纤维细胞，以及子宫内膜细胞等。1.STO饲养层细胞的制备™商品化的STO细胞培养胰酶消化离心计数把细胞悬液加到培养孔中培养丝裂霉素C处理™缺点：在以STO细胞为饲养层前需用丝裂霉素C处理，其会对胚胎干细胞产生毒害作用；同时STO细胞死亡时释放的细胞碎片和废物也会影响胚胎干细胞的成长，难以获得较纯的胚胎干细胞。2.PEMF饲养层细胞的制备™选取并处死小鼠取出胎儿剪碎胚胎消化取得成纤维细胞培养冻存处理复苏处理培养™缺点：用丝裂霉素C处理的原代成纤维细胞的存活时间较短，一般只有4~6d。死亡的细胞释放一些DNA片段或酶进入培养基中，干扰胚胎干细胞的正常生长。随着传代次数的增加，成纤维细胞分泌LIF能力下降。因此只选用3~6代。（二）、胚胎干细胞的分离™1.胚胎的培养将检出的胚胎，冲洗数次后移入培养小滴中，放入CO2培养箱中培养，得到囊胚。™2.胚胎干细胞的分离方法：A：培养法B：免疫手术法3、培养条件：(1)特殊的培养液：用DMEM培养液，其中胎牛血清的浓度和质量很重要，还要加非必须氨基酸；β-巯基乙醇等。(2)以人或胚鼠的成纤维细胞为饲养细胞。(3)必须加入LIF，抑制细胞分化。A.胚胎培养法分离™1）培养液：囊胚及胚胎干细胞培养用的培养液。™2）胚胎培养：a.在培养的前一天，准备好饲养层；b.吸出其中的饲养层培养液，代之以胚胎培养液；c.把囊胚移入饲养层上培养；d.每日检查，注意囊胚的形态和大小；e.24—36小时后，囊胚自透明带中孵出，并贴壁，内细胞团（ICM）突出于滋养层外；f.4—6天后，ICM细胞增殖为小细胞群。获得发育良好的胚胎体外培养在饲养层上培养获得ES克隆挑出后继续培养保持未分化状态B.免疫手术法™免疫手术法在分离内细胞团过程中较为通用，而且易于获得较纯净的胚胎干细胞，但要掌握好处理的程度，以免伤及内细胞团细胞。™过程：胚胎在含有兔抗鼠血清的DMEM培养液中培养15－25分钟，再在含有豚鼠抗兔血清的DMEM培养液中培养10－20分钟，这样滋养层细胞即被破坏，去除已溶解的滋养层细胞，得到胚胎的内细胞团。3.内细胞团的初次传代™吸出培养液，加入无Ca-Mg的PBS；™将ICM推离滋养层，并移入胰酶-EDTA消化液中；™消化5分钟后，加入等量的培养液，终止消化，并用吸管吹打，制成单细胞悬液；™将单细胞悬液移入饲养层细胞之上培养；™几天后会形成克隆，由这些克隆选择ES细胞。4.抑制分化™多种细胞团子均可作为外源性分化抑制因于抑制ES细胞的分化，如白血病抑制因子（Leukemiainhibitorfactor,LIF）、白细胞介素6（Interleukin-6,IL-6）、睫状神经营养因子（Ciliaryneurotrophicfactor,CNTF）等。其中研究最多、使用最广泛的是LIF。5.ES细胞的扩增与保持™扩增：克隆分离传代培养™保持：传代培养:保持快速的增殖速度和相对高的密度状态，以防止分化；保证细胞为单个细胞，细胞成团，易分化；每天换液，3-4天传代一次。冷冻保存：在-70度可保持2-3年仍有活力。三、胚胎干细胞系的鉴定™1形态鉴定ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态特征，细胞体积小，圆形，核质比大，有1-2个核仁；细胞致密，细胞间无界限，形似鸟巢，集落周边整齐，与饲养层界限分明且色泽深亮。™2核型分析正常的二倍体校型特征是ES细胞全能性（或多能性）的基础，只有具有正常核型的胚胎干细胞才能嵌合到受体着床前胚胎内，共同分化发育成嵌合体动物。™3体外分化当培养密度高时，ES细胞会发生自发分化，形成肌细胞、成纤维细胞、神经细胞和内胚层细胞等。另外，若将ES细胞消化离散后悬浮培养，几天后形成细胞团，且在细胞团的一端出现边缘平滑的立方上皮细胞，另一端出现表面粗糙、非紧密连接的细胞，这些细胞团的发育形式与人畸胎瘤细胞相似。进一步培养形成类胚体，类胚体贴壁后，可分化形成外胚层、内胚层以及神经和肌肉细胞。™4体内分化将分散的ES细胞，注射到裸鼠体例皮下（每侧约5×106个），6－8周后肿瘤形成。手术取瘤，常规方法制组织切片，染色并观察分析结果。分化潜能高的细胞肿瘤形成迅速，且分化细胞类型多。所形成的肿瘤必须有内、中、外三种胚层来源的细胞，才能证明胚胎干细胞具有完整的全能性。™5特异性染色常用的是碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase，AKP）染色和阶段性胚胎特异性抗原-1（Stage-Specificembry-onicantigen-1,SSEA-1）SSEA-3，SSEA-4等免疫荧光标记染色两种方法。ES细胞和早期胚胎细胞等未分化的细胞表面含有丰富的AKP和SSEA-1，用特异性染色，即可进行检测。SSEA一1免疫荧光标记染色一般采用间接法，以提高其敏感性。常以抗SSEA－1单克隆克隆抗体为一抗，荧光标记的羊抗鼠lgG为二抗，分步染色，荧光显微镜下观察分析结果。™6嵌合体通过显微注射法，向囊胚期胚胎的囊胚腔注射15－20个ES细胞，再经胚胎移植手术，将其植入受体并产生后代。然后，通过检测ES细胞在嵌合体中的表达，确定其全能性或多能性。四、人胚胎干细胞系的建立JamesA.Thomson在Wisconsin大学领导一个研究小组从人胚胎组织中培养出了干细胞株。他们使用的方法是：人卵体外受精后，将胚胎培育到囊胚阶段，提取innercellmass细胞，建立细胞株。经测试这些细胞株的细胞表面marker和酶活性，证实它们就是胚胎干细胞。用这种方法，每个胚胎可取得15－20个细胞用于培养。JohnD.Gearhart在JohnsHopkins大学领导另一个研究小组也从人胚胎组织中建立了干细胞株。他们的方法是：从受精后5－9周人工流产的胚胎中提取生殖母细胞(primordialgermcell)。由此培养的细胞株，证实具有干细胞的特征。EmbryonicStemCellLinesDerivedfromHumanBlastocystsJamesA.ThomsonetalScience1998,286:1145-1147EmbryonicStemCellLinesDerivedfromHumanBlastocystsJamesA.ThomsonetalScience1998,286:1145-1147EmbryonicStemCellLinesDerivedfromHumanBlastocystsJamesA.ThomsonetalScience1998,286:1145-1147五、胚胎干细胞的分化™在单层培养条件下，能自发分化成多种细胞；™在悬浮培养时，能形成类胚体，像早期胚胎那样有序进行分化；™体外可在某些物质的诱导下进行定向分化。去除LIF等分化抑制因子，ES细胞开始分化。适当条件改变生长环境处理塑料平皿、加入特定生长因子等心肌细胞上皮细胞脂肪细胞神经细胞胚胎干细胞体外定向分化胚胎干细胞的诱导分化：胎牛血清，骨髓基质细胞共培养胚胎干细胞--------------------------------------------Æ造血细胞RA胚胎干细胞----------------------------Æ神经细胞DMSO胚胎干细胞----------------------------Æ肌肉细胞TGF-B1,VEGF,bFGF胚胎干细胞----------------------------Æ血管和内皮细胞RA+胰岛素+T3胚胎干细胞----------------------------Æ脂肪细胞BMP-2,BMP-4胚胎干细胞----------------------------Æ软骨细胞地塞米松，磷酸甘油胚胎干细胞----------------------------Æ骨细胞基因转染胚胎干细胞----------------------------Æ胰岛素分泌细胞干细胞诱导分化的常用方法（1）加入诱导细胞分化的因子或化学物质，如VGEF、bFGF、DMSO和RA等（2）将ES细胞与特定的细胞共培养（3）将某种分化诱导因子的基因转入ES细胞内鉴定诱导分化后组织干细胞的常用方法：（1）细胞形态与结构（2）细胞功能（3）细胞表面的特殊标志（4）细胞内特异基因的表达造血干细胞的鉴定：（1）细胞形态：集落呈非贴壁生长，细胞形态较小（2）细胞表面标志：flk-1（FetalLiverKinase1);L/TAL-1；CD34；GATA-1；（3）基因表达：TAL-1；GATA-2；βH1；β珠蛋白内皮细胞:（1）细胞形态：扁平贴壁状态；Weibel-Palade小体；广泛胞内连接；大量吞饮泡；（2）细胞标志：血小板内皮细胞粘附分子PECAM-1或CD31；细胞粘附分子整合素αvβ3；CD34；JAM(JunctionalAdhesionMembrane)；MECA-32以及MEC-14，7抗原；（3）特异基因表达：flk-1；flt-1；tie-2。心肌干细胞：（1）细胞结构：细胞内含糖原颗粒，大量线粒体以及广泛的未形成成熟肌原纤维的粗丝和细丝（2）细胞功能：节律性收缩；心肌特异离子流。利用膜片钳技术可检测L型Ica，Ina，Ito，Ik，Ik1，Ik，ACH和If（3）基因表达：α及β心肌球蛋白重链。神经干细胞:（1）细胞形态：胞体很小，从胞体伸出许多长的神经突（2）细胞功能：电压控制性Na+，K+，Ca2+通道；神经递质的受体（3）细胞标志：TH（酪氨酸羟化酶），微管相关蛋白tau，MAP2，β微管蛋白3（TuJ-1），GFAP（胶质原纤维酸性蛋白），巢蛋白，突触泡蛋白以及NF-L（68KDa的神经丝蛋白），NF-H（200KDa的神经丝蛋白），NF-M（160KDa的神经丝蛋白）；Nurr1和Ptx3（中脑多巴胺能神经元的标志）（4）特异基因表达：5天的EBs中有NF-L，N