实验一谷胱甘肽

4/25/202014/25/2020从酵母中提取谷胱甘肽4/25/202024/25/2020实验目的•掌握从干酵母中粗提谷胱甘肽的各种方法；•掌握谷胱甘肽含量测定的方法。4/25/202034/25/2020实验材料•试剂：活性干酵母粉，1mol/L盐酸，0.25mol/L氢氧化钠，硫酸铵饱和溶液，固体硫酸铵，8mol/L氨水，1%亚硝基铁氰化钠001×7树脂（凝胶型苯乙烯强酸性阳离子交换树脂）仪器：真空抽滤机分光光度计层析柱4/25/202044/25/2020实验原理•谷胱甘肽的性质•从活性干酵母中提取谷胱甘肽的原理及评价方法优劣的指标•提取的注意事项•工业上提取谷胱甘肽的流程4/25/202054/25/2020谷胱甘肽的性质1.谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽，半胱氨酸侧链基团上连有一个活泼的巯基决定了其有氧化型（GSSG）和还原型（GSH）两种形式。2.谷胱甘肽的分子量为307.2，等电点为5.93，溶于水、稀醇、有机酸、酯类，不溶于醇、醚、丙酮；在水溶液中易被氧化，在pH3.0~7.0环境下较稳定。3.谷胱甘肽广泛存在于动、植物和微生物体内，干酵母中含有约1％谷胱甘肽，是提取谷胱甘肽最常用的原料。•生理功能抗氧化、清除自由基、解毒（CO、重金属）等。4/25/202064/25/2020相关应用医学：1其巯基以螯合重金属、氟化物、芥子气等毒素中毒2在肝炎、溶血性疾病以及角膜炎、白内障和视网膜疾病等，作为治疗或辅助治疗的药物。3近来日本学者发现谷胱甘肽具有抑制艾滋病毒的功能4养颜美容护肤，防止皮肤老化及色素沉着，减少黑色素的形成食品1加入到面制品中，缩短面包制造时间并起到食品营养的强化作用及其他功能2加入到酸奶和婴幼儿食品中，相当于维生素C，可起到稳定剂的作用3加到肉制品和干酪等食品中，具有强化风味的效果。4/25/202074/25/2020原理•提取原理谷胱甘肽是小分子物质，且在水中的溶解度较大，故可选择一些温和的方法从干酵母中提取谷胱甘肽。在细胞不完全破碎的条件下，只要细胞壁表面出现一些裂缝，谷胱甘肽就可以扩散到水中4/25/202084/25/2020工业上提取谷胱甘肽的流程酵母高产酵母诱变剂：亚硝基胍、紫外线热水抽提离心去残渣提取液调pH7.0左右吸附层析法：壳聚糖做吸附剂pH4.5左右的磷酸盐缓冲液洗脱浓缩脱色喷雾干燥成品4/25/202094/25/2020注意事项•提取时间要尽量短，防止其被氧化；•提取温度要尽量低，但反复冻融谷胱甘肽易分解•谷胱甘肽在偏酸性的条件下易保持还原态；•适当的固液比，既保证尽量多的谷胱甘肽被溶出也保证提取液中谷胱甘肽的浓度较高，便于后续的分离纯化。•适当的搅拌速度，既保证适当的传质速度，便于谷胱甘肽扩散到溶剂中，也保证工业生产中能耗适当。4/25/2020104/25/2020提取方法介绍1.热水提取法：1g干酵母，加15mL热水，95度水浴10min，立即冷却，取8mL离心（5000rpm，15min），取5mL上清液滴定，记录滴定体积。2.冷冻研磨处理后有机酸搅拌提取：1g干酵母，先在研钵中研细，加入10mL蒸馏水混匀，－20度冷冻呈半固体状，研磨5min，加入5mL36％乙酸，室温下搅拌提取15min，取8mL离心（5000rpm，15min），取5mL上清液滴定，记录滴定体积。3.酸热处理酸水搅拌提取：1g干酵母，加入15mL2％H2SO4，60度水浴下搅拌抽提15min，立即冷却，取8mL离心（5000rpm，15min），取5mL上清液滴定，记录滴定体积4.有机酸－稀醇搅拌提取：1g干酵母，加入15mL乙酸－乙醇混合液（v:v=2:1），室温下搅拌抽提15min，取8mL离心（5000rpm，15min）取5mL上清液滴定，记录滴定体积。注：待滴定的谷胱甘肽提取液置4度冰箱保存，防止其被氧化4/25/2020114/25/2020含量测定1.在试管中加入1g硫酸铵粉末，1ml谷胱甘肽待测液，3ml硫酸铵饱和溶液，摇匀2.加0.5ml1%亚硝基铁氰化钠，再加入0.7ml8mol/L氨水溶液，混合3.用分光光度计在525nm进行比色，读取吸光度4.根据公式计算出谷胱甘肽的浓度Y=4.0914X+0.0028Y是光密度值，x是谷胱甘肽的浓度，单位mg/l4/25/2020124/25/2020实验结果记录与分析4/25/2020134/25/2020