副溶血性弧菌

副溶血性弧菌Vibrioparahaemolyticus目录一、引起疾病症状（致病性、流行病学情况）二、基本情况及特征三、培养特性四、生化特性五、抗原特征六、检验方法（举例阐述检验某一食品、商品中该菌的详细操作过程）一.副溶血性弧菌疾病症状副溶血性弧菌（BibrioParahemolyticus），进食含有该菌的食物致可食物中毒，也称嗜盐菌食物中毒。副溶血弧性菌常导致肠胃不适，伴随食物中毒等症状。表现为急性肠胃炎，腹痛、吐泻、发烧等特征。少数重症者引起原发性败血症。副溶血性弧菌的发现于1950年10月从日本大阪市，发生的一起咸沙丁鱼食物中毒，患者肠道排泄物和食物中首次分离出副溶血性弧菌。在日本，副溶血性弧菌食物中毒约占细菌性食物中毒的70%～80%.1958年上海市防疫站也从烤鸭所致食物中毒的患者中分离出此菌。以后在我国、日本、印度、美国等许多国家均陆续报道有本病的发生。1966年国际弧菌命名委员会正式命名为副溶血性弧菌。中毒食品主要是海产品鱼、虾、蟹、贝类和海藻等海产品，其次为咸菜、熟肉类、禽肉、禽蛋类，约有半数中毒者为食用了腌制品后。中毒原因主要是烹调时未烧熟煮透或熟制品被污染．副溶血性弧菌致病性致病因子：1、耐热直接溶血素TDH，肠毒素2、耐热相关溶血素TRH，与TDH相似。副溶血性弧菌的流行病学1、传染源传染源为病人，集体发病时往往仅少数病情严重者住院，而多数未住院者可能成为传染源，但由于病人仅在疾病初期排菌较多，其后排菌迅速减少，故不至因病人散布病菌而造成广泛流行。2、传播途径本病经食物传播，主要的食物是海产品或盐腌渍品，常见者为蟹类、乌贼、海蜇、鱼等，其次为蛋品、肉类或蔬菜。进食肉类或蔬菜而致病者，多因食物容器或砧板污染所引起。3、易感者男女老幼均可患病，但以青壮年为多，病后免疫力不强，可重复感染。本病多发生于夏秋沿海地区，常造成集体发病。近年来沿海地区发病有增多的趋势。预防措施1、动物性食品应煮熟煮透再吃。2、注意海鲜是否干净、新鲜，食前应用淡水反复冲洗，吃时煮熟煮透，再加适量食醋；3、生熟食品分开存放，装海产品的器具及接触海产品的手应洗净擦干再接触其他食品。二、基本情况及特征大小：0.7~1.0μm，有时有丝状菌体，可长达15μm特征：一端有鞭毛，运动活泼，菌周有鞭毛革兰染色阴性需氧菌,无芽孢，两端有浓染现象，其中间着色较淡或不着色。菌体形态呈多型性，主要出现的形态有球状、球杆状、卵圆状和丝状。三、培养特性1、需氧菌，需氧性很强，营养要求不高。2、在含盐3～3.5%培养基中生长最好，无盐条件下不能生长。3、最适温度30~37℃，PH7.4~8.0。4、不耐热，不耐冷，不耐酸，对常用消毒剂抵抗力弱。在液体培养基中，呈现浑浊，表面形成菌膜，R型菌发生沉淀。在固体培养基上的菌落通常为隆起，圆形，稍混浊，不透明，表面光滑湿润，传代之后出现不圆整、粗糙型菌落，或灰白色半透明或不透明的菌落。在血琼脂平板上菌落的周围可见溶血环，某些菌株可形成β溶血或α溶血。本菌在伊红美兰琼脂上不生长，某些菌株在麦康凯上生长，生长的菌落呈圆形，平坦、半透明或浑浊，略带红色。伊红美蓝琼脂培养基主要成分：蛋白胨、乳糖、磷酸氢二钾、伊红、美蓝、琼脂粉、蒸馏水。麦康凯培养基：蛋白胨17g，脙胨3g，猪胆盐(或牛、羊胆盐)5g，氯化钠5g，琼脂17g，蒸馏水1000mL，乳糖10g，0.01%结晶紫水溶液10mL，0.5%中性红水溶液5mL在SS平板上，菌落中等大小，长出1～2mm扁平、无色、半透明的菌落，不易挑起，挑起时呈粘稠状。典型的副溶血性弧菌在TCBS琼脂培养基呈圆形、半透明、表而光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径2mm--3mm。注：TCBS中文名：硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖琼脂培养基。成分：酵母粉5.0,蛋白胨10.0,硫代硫酸钠10.0,枸橼酸钠10.0,牛胆粉5.0,牛胆酸钠3.0,蔗糖20.0,氯化钠10.0,柠檬酸铁1.0,麝香草酚兰0.04,琼脂15.0,pH值8.6±0.1,典型的副溶血性弧菌在弧菌显色培养基上呈圆形、半透明、表面光滑的粉紫色菌落，直径2mm--3mm.注：显色培养基成分：特殊营养物质（75.0g/L）、混合显色剂（2.3g/L）、琼脂（15.0g/L）。显色培养基是一类利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色的原理来检测微生物的新型培养基。四、生化特性能分解葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、淀粉和阿拉伯胶糖，产酸，不产气。不发酵乳糖、蔗糖、纤维二糖等。从患者样品中分离的致病菌株在人或家兔红细胞的培养基中生长，能产生β溶血。海水中及海产品中分离的菌株不溶血，这个现象称为“神奈川现象”。能在神奈川培养基上产生β溶血者，称为神奈川实验阳性。试验项目结果革兰氏染色镜检阴性，无芽孢氧化酶+动力+蔗糖-葡萄糖+甘露醇+分解葡萄糖产气-乳糖-硫化氢-赖氨酸脱羧酶+VP-ONPG-阳性：+阴性：-副溶血性弧菌的生化性状3％氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深。嗜盐性试验挑取纯培养的单个可疑菌落，分别接种0%、6%、8%和10%不同氯化钠浓度的胰胨水，36℃±1℃培养24h，观察液体混浊情况。副溶血性弧菌在无氯化钠和10%氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长，在6%氯化钠和8%氯化钠的胰胨水中生长旺盛。嗜盐性试验6％NaCL10％NaClMR试验方法MR试验方法：取一种细菌的24h培养物，接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37℃培养48～72h，取出后加甲基红试剂3～5滴，凡培养液呈红色者为阳性，以‘‘十”表示；橙色者为可疑，以“±”表示；黄色者为阴性，以“—”表示。VP试验方法VP试验方法：取一种细菌的24h纯培养物，接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37'C培养48～72h取出后在培养液中先加VP试剂甲液0.6mL，再加乙液0.2mL，充分混匀。静置在试管架上，15min后培养液呈红色者为阳性，以“”表示；不变色为阴性，以“—”表示。1h后可出现假阳性。或者可以用等量的硫酸铜试剂于培养液中混合，静置，强阳性者约5min后就可产生粉红色反应。MR:阳性（红色）左侧为阴性对照VP：阴性五、抗原的特征O抗原是耐热的菌体抗原，目前有O1~O13共13种，可用于血清学鉴定。K抗原是一种荚膜抗原，现有K1~K71，也用于血清学鉴定。中国大陆副溶血弧菌大部分是O3：K6。六、检验实验目前副溶血性弧菌的检验采用国标法（GB/T4789.7—2013）设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：a)恒温培养箱：36℃±1℃；b)冰箱：2℃～5℃、7℃～10℃；c)恒温水浴箱：36℃±1℃；d)均质器或无菌乳钵；e)天平：感量0.1g；f)无菌试管：18mm×180mm、15mm×100mm；g)无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头；h)无菌锥形瓶：容量250mL、500mL、1000mL；i)无菌培养皿：直径90mm；j)全自动微生物生化鉴定系统；k)无菌手术剪、镊子。培养基和试剂3％氯化钠碱性蛋白胨水、硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂、3％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂、3％氯化钠三糖铁琼脂、嗜盐性试验培养基、3％氯化钠甘露醇试验培养基、3％氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基、3％氯化钠MR-VP培养基、3％氯化钠溶液、我妻氏血琼脂、氧化酶试剂、革兰氏染色液、ONPG试剂、Voges-Proskauer（V-P）试剂、弧菌显色培养基、生化鉴定试剂盒。副溶血性弧菌检验程序1.样品制备冷冻样品应在45℃以下不超过15min或在2-5℃不超过18小时解冻。非冷冻而易腐蚀的样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置7-10℃冰箱保存，在24h内检验。鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃.贝类取全部内容物,包括贝肉和体液,甲壳类取整个动物，或者动物的中心部分,包括肠和鳃。以无菌操作取检样25g（或ml），加人3％氯化钠碱性蛋白栋水225ml，用旋转刀片式均质器以8000r/min取均质1min，或拍击式均质器拍击2min，制备成1：10的均匀稀释液。如无均质器，则将样品放人无菌乳钵中磨碎，然后放500mL的灭菌容器内,加225ml3%氯化钠碱性蛋白胨水，并充分振荡。2、增菌（1）定性检测将制备好的1:10样品匀液于36℃±1℃培养8h～18h。（2）定量检测•用无菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，注入含有9mL3%氯化钠碱性蛋白胨水的试管内，振摇试管混匀，制备1:100的样品匀液。•另取1mL无菌吸管，按之前操作程序，依次制备10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释一次，换用一支1mL无菌吸管。•根据对检样污染情况的估计，选择3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种3支含9mL3%氯化钠碱性蛋白胨水的试管，每管接种1mL。置36℃±1℃恒温箱内，培养8h～18h。3.分离a.对所有显示生长的增菌液，用接种环在距离液面以下1cm内沾取一环增菌液，于TCBS平板或弧菌显色培养基平板上划线分离。一支试管划线一块平板。于36℃±1℃培养18h～24h。b.典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径2mm～3mm。从培养箱取出TCBS平板后，应尽快（不超过1h）挑取菌落或标记要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在弧菌显色培养基上的特征按照产品说明进行判定。4.纯培养挑取三个或以上可疑菌落，划线3％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36℃土l℃培养18h--24h.5.初步鉴定氧化酶试验挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，副溶血性弧菌为氧化酶阳性。涂片镜检将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色．镜检观察形态。副溶血性弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞，有鞭毛.3﹪氯化钠三糖铁琼脂挑取纯培养的单个可疑菌落，转种3%氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层，36℃±1℃培养24h观察结果。副溶血性弧菌在3%氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深。嗜盐性实验6.确定鉴定取纯培养物分别接种含3%氯化钠的甘露醇试验培养基、赖氨酸脱羧酶试验培养基、MR-VP培养基，36℃±1℃培养24h～48h后观察结果；3%氯化钠三糖铁琼脂隔夜培养物进行ONPG试验。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。ONPG试验β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）简介（1）β-半乳糖苷酶试验原理：有的细菌可产生β-半乳糖苷酶，能分解邻-硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG），而生成黄色的邻-硝基酚，在很低浓度下也可检出。（2）试剂：0.75MONPG溶液：取80mg溶于15ml蒸馏水中，在加入缓冲液（6.9gNaH2P04溶于45ml蒸馏水中，用30%NaOH调整pH为7.0，再加水至50ml）5ml，置4℃冰箱中保存。0NPG溶液为无色，如出现黄色，则不应再用。（3）方法：从培养基上取菌，于0.25ml无菌生理盐水中制成菌悬液，加入一滴甲苯并充分振摇，使酶释放。将试管置37℃水浴5min，加入0.25mlONPG试剂，水浴20min～3h观察结果。（4）结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在20～30min内显色。（5）应用：迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。本实验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。API2OE生化鉴定试剂盒可在24小时内鉴定革兰阴性杆菌:108种不同的菌种或项(肠杆菌科、弧菌科、非发酵革兰阴性杆菌)。API20E操作既快速又简便，选取单个菌落，在试条及试条包装袋上提示有操作过程，反应的颜色变化清晰。神奈川试验（选做项目）神奈川试验是在我妻氏琼脂上测试是否存在特定溶血素。神奈川试验阳性结果与副溶血性弧菌分离株的致病性显著相关。用接种环将测试菌株的3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂18h培养物点种于表面干燥的我妻氏血琼脂平板。每个平板上可以环状点种几