矿物微生物浸出12

426第12章矿物微生物浸出12.1概述中国是世界上最早采用微生物湿法冶金技术的国家。早在公元前2世纪，就记载了用铁自硫酸铜溶液中置换铜的化学作用，而堆浸和筑堆浸出在当时已成为生产铜的普通做法。到了唐朝末年或五代时期，出现了从含硫酸铜矿坑水中提取铜的生产方法，称为“胆水浸铜”法。到北宋时期，该方法已成为铜的重要生产手段之一。当时有十一处矿场用这种方法生产铜，产量达百万斤，占全国总产量的15%～25%。在欧洲，有记载的最早涉及细菌采矿活动是1670年在西班牙的里奥廷托（RioTinto）矿，人们利用酸性矿坑水浸出含铜黄铁矿中的铜。然而，在所有这些早期的溶浸采矿活动中，人们对浸出液中存在微生物且发挥着重要的浸矿作用却一无所知，只是不自觉地利用了它们。1947年柯尔默（Colmer）和亨科尔（Hinkle）首次从酸性矿坑水中分离出一种微生物－氧化亚铁硫杆菌（Thiobacillusferrooxidans），并对其生理特性进行了鉴定。其后坦波尔（Temple）、莱顿（Leathen）等对这种自养菌的生理生态进行了详细研究。发现这种微生物能将矿物中硫化物组分氧化生成硫酸，并能将二价铁离子氧化为三价铁离子。这些研究成果对促进微生物湿法冶金的发展具有重要意义。正是由于揭示了氧化亚铁硫杆菌这种生理特性，50年代掀起了生物湿法冶金研究的高潮。1954年布莱涅（Buyner）等人从废铜矿堆的流出水中分离出该种细菌。在实验室用此菌对多种铜硫化矿进行浸出试验，证明该菌可以氧化大多数硫化矿。1958年美国肯尼柯特（Kennecott）铜矿公司的尤他（Utah）矿，首先利用该菌渗滤浸出硫化铜矿获得成功，并取得这项技术的专利。从此细菌浸出的研究和应用开始受到各国重视，许多国家相继开展了由贫矿、废矿及表外矿石细菌浸出回收铜和铀的研究工作。从20世纪60年代起细菌浸出铜和铀的技术用于工业生产。近20年来，细菌冶金已成为湿法冶金领域的热门研究课题。研究内容包括浸矿细菌的分离和鉴定、细菌浸出工艺、浸出动力学及浸出机理等等。细菌浸出金属的种类也增加了，除Cu、U外，还有Ni、Zn、Co、Mn等有色金属及某些稀有金属，和Au,Ag等贵金属。如今细菌冶金已发展成为一种新的湿法冶金方法，它的内容既包括从矿物中提取各种金属，也包括在其他湿法冶金工艺方法提取金属时用生物法除去干扰有害组分。42712.2浸矿微生物12.2.1浸矿微生物的种类、来源及生理生态特性在自然界有一类微生物，可直接或间接地参与金属硫化矿物的氧化和溶解过程。可在金属硫化矿和煤矿的矿坑水以及土壤中找到它们的踪迹。和矿物浸出有关的微生物大部分属于自养菌，这类微生物在生长和繁殖过程中，不需要任何有机营养，而是完全靠各种无机盐而生存。还有一类微生物则与之相反，它们需要提供现成的有机营养才能生存，叫做异养菌。某些异养菌也可以溶浸金属矿物，但研究比较充分、在生产中得到实际应用的主要是自养类微生物，下面简要介绍几种常见的浸矿自养菌。（1）排硫杆菌（Thiobacillusthioparus）该菌是硫杆菌属中较常见的一种，菌体呈杆状，在液体硫代硫酸盐培养基上可以生成小而圆的菌落，由于生成硫沉淀，菌落呈黄色。该菌通常只存活一个星期左右，它可将硫代硫酸盐氧化成元素硫，又将元素硫氧化成硫酸。（2）氧化硫硫杆菌(Thiobacillusthiooxidans)该菌为圆头短杆状，通常以单个或成双、成短链状存在，在菌体两端各有一油滴，可将培养基中的硫溶入油滴之中再吸入体内进行氧化，该菌氧化元素硫的能力比氧化硫化合物的能力强，可以产生较多的酸，并有较强的耐酸性能，可耐5%的硫酸。（3）蚀阴沟硫杆菌(Thiobacillusconcretivorus)该菌与氧化硫硫杆菌类似，但它可以利用硝酸盐和铵离子作为氮源，不能利用亚硝酸盐。（4）氧化铁铁杆菌(Ferrobacillusrerrooxidans)该菌呈短杆状，可将亚铁离子氧化成高铁离子，在液体培养基中由于生成Fe3+使培养基由浅绿色变成红棕色，在固体培养基上长成红棕色菌落。（5）氧化铁硫杆菌(Thiobacillusferrooxidans)该菌是浸矿细菌中最常见的一种自养菌，菌体呈杆状。它可以氧化亚铁为高价铁，也可将硫代硫酸盐氧化为硫酸。在含亚铁的液体培养基中由于亚铁被氧化使培养基变成红棕色，最后由于Fe3+水解生成氢氧化物或铁矾而产生沉淀。固体培养基上生长成棕色菌落。如用不含铁的液体培养基，则由于硫代硫酸盐氧化生成硫酸，使培养基酸度提高。以上几种菌都属于化能自养菌，它们靠氧化培养基中的亚铁离子或硫化合物取得能量，以空气中的CO2作为碳源，并吸收培养基中的氮、磷等无机盐营养，合成菌体细胞。它们之间除利用的能源有差异外，其他性质都十分相近。这些菌生活中需要氧气，属于好氧菌，它们广泛生活于金属硫化矿和煤矿等矿山的酸性矿坑水中。以上几种浸矿细菌的特性如表12-1所示。428表12-1几种主要浸矿细菌的特性菌名特性T.Thiooxidans氧化硫硫杆菌T.Concretivorus蚀阴沟硫杆菌T.Ferrooxidans氧化铁硫杆菌F.Ferrooxidans氧化铁铁杆菌菌体大小活动性鞭毛格兰氏染色适宜生长pH适宜生长温度需氧情况碳源（大气Co2）碳源（铵态氮）硝酸盐氮氧化物硫磺亚铁硫代硫酸盐0.5×1.0μ+单鞭毛-2.0～3.528～30℃+++--+-+0.5×1.5～2.0μ+极生鞭毛-2.0～4.028℃++++++-+0.5×1.0μ+极生鞭毛-2.5～3.530℃+++-+-++0.6～1.0×1.0～1.6μ+极生鞭毛-3.515～30℃+++--+-注：表中“+”表示细菌能运动，需要和能利用；表中“-”表示格兰氏染色为阴性或不能利用。其中氧化硫硫杆菌、氧化铁铁杆菌和氧化铁硫杆菌三种自养菌的性能十分相近，而且难以将它们分开，所以有人视它们为一种菌，定名为氧化铁硫杆菌。氧化铁硫杆菌的显微摄影照片如图12-1所示。图12-1氧化铁硫杆菌的显微照片42912.2.2浸矿细菌的培养基微生物赖以生存和繁殖的介质叫培养基，分液体培养基和固体培养基两种。液体培养基用于粗略地分离培养某种微生物，而要进行微生物的纯种分离则要用固体培养基。浸矿自养菌的液体培养基是由水和溶在水中的各种无机盐组成的。每种细菌都有自己特有的培养基配方，这些配方是经过研究者的试验研究之后提出的。现将几种常见浸矿细菌的培养基配方列于表12-2。表12-2氧化亚铁硫杆菌用培养基名称组成Leathen(g/L)9K(g/L)Waksman(g/L)ONM(g/L)Colmer(g/L)(NH4)2SO4KClK2HPO4MgSO4•7H2OCa(NO3)2蒸馏水pHFeSO4•7H2OCaCl•2H2O硫磺粉Na2S2O3•5H2OCaCl20.150.050.050.050.011000ml2.010%(W/V)溶液10ml3.00.10.50.50.01700ml2.014.7%(W/V)溶液300ml0.20.51000ml2-3.50.010.2510240.31000ml2-3.50.010.25100.230.11000ml1.5-2.050.2注：除Colmer培养基外，氧化铁硫杆菌还可以用Leathen和9K培养基。用作平板分离的固体培养基，是在上述液体培养基中加入1.5%琼脂（洋菜）或一定量硅胶制成的。首先在加热条件下配成一定浓度的琼脂溶液，该溶液消毒后再加入无菌过滤的FeSO4等无机盐母液，用H2SO4调节好酸度，冷却至常温即制成固体培养基。12.2.3细菌的采集、分离和培养浸矿细菌分布较广，土壤、水体及空气中都可能存在。但相对比较集中的地方是金属硫化矿及煤矿的酸性矿坑水，所以采集这类菌的最佳取样点是煤矿、铜矿、铀矿等有酸性矿坑水的地方。现将浸矿细菌当中最常见的氧化铁硫杆菌的采集和分离培养方法简述如下。取50mL～250mL细口瓶，洗净并配好胶塞，用牛皮纸包扎好瓶口，置于120℃烘箱灭菌20min，待冷却后即可作为细菌取样瓶，带取样瓶到上述矿山取酸性坑水。如矿坑水的pH值为1.5～3.5并呈棕色（说明有Fe3+存在），则很可能存在氧化铁硫杆菌。可对此水样进行取样分离培养。430为了分离培养所需细菌，还需配制好专供这种菌生长的Leathen或9K培养基。配好的培养基用蒸汽灭菌15min，然后在无菌操作下分装于数个事先洗净并灭菌的100mL三角瓶中。每瓶装培养基20mL，用洗净干燥的吸液管分别取1mL～5mL矿水样加到各三角瓶中，塞好棉塞置于20℃～35℃恒温条件下，静置培养（或振动培养）7天～10天。由于细菌生长繁殖，三角瓶中培养基的颜色由浅绿变为红棕色，最后在瓶底出现高铁沉淀（与空白对照），选择变化最快，颜色最深的三角瓶，在瓶中取1mL培养液，接种到装有新培养基的三角瓶中，同样培养。培养液将比头一次更快的变红棕色。以后按同样办法反复转移培养，到少10次以上。每转移一次，接种量逐渐减少，只需1滴～2滴就可以，而所培养的细菌却越来越活跃，只需培养3天～5天就可把培养基中的Fe2+氧化为Fe3+。在转移培养中，借助培养基的高酸度，可杀死淘汰掉一些不嗜酸的杂菌，又由于培养基中的高浓度亚铁离子，只有氧化亚铁的细菌才能生长繁殖，其他菌则被杀死淘汰掉，而氧化铁硫杆菌则得到充分繁殖，活性越来越大。可用如下方法对所培养的氧化铁硫杆菌进行初步检查和鉴定。（1）肉眼观察如有该菌生长，则培养基中的亚铁将被氧化变成高铁，培养基的颜色由浅绿变成红棕色，最后产生高铁沉淀。（2）重铬酸钾容量法测定用重铬酸钾容量法测定培养液中亚铁变成高铁的数量。变化快的，说明细菌生长旺盛。（3）显微镜观察通过显微镜观察细菌的形成，是否具有氧化铁硫杆菌的形状特征。用上述方法得到的菌种是不纯的，如要分离纯种，上述分离过程要无菌操作，并且要作平板分离。但一般生产中应用，不需纯种菌。菌种培养好后，置于冰箱（4℃）条件下保存，但过一定时间需重新转移培养。工业生产用菌的大量繁殖培养，须在专门的设备中进行。平板分离（也可用斜面分离）的目的是把混合的具有氧化亚铁能力的细菌分离，获得从单一细胞来的纯菌种。方法是把配制好的固体培养基倒入培养皿制成平板，然后在无菌操作下，用接种环取上述培养菌液在平板上划线分离，使所取菌液中的菌体细胞尽量沿划线分散开，然后将划好的线培养皿在25℃～30℃条件下恒温培养。经10天左右就可以看到由单个菌株长成的很小的褐色菌落（可借解剖镜观察），挑选适当菌落用取样针转移到装有数毫升培养基的小试管中恒温培养，一般7天左右培养液就可变成红棕色。将此培养液重新在固体培养基上划线分离，如此反复进行数次分离和培养，就可获得纯菌株。将这些由单一菌落来的培养物分别进行鉴定，具体方法可参见一般微生物方法手册。43112.2.4细菌生长曲线微生物的生长繁殖过程，按其繁殖速度的快慢和活性大小，可以分成四个时期，即生长缓慢期、对数生长期、稳定生长期和衰亡期。这几个时期可以用细菌生长曲线表示，如图12-2。当细菌由一个环境转移到一个新的环境时，会出现一个逐步适应的缓慢生长期，这个时期细菌的生长繁殖速度很慢，细菌也不活跃。根据被培养细菌对环境的适应性，这个时期可能很短，也可能较长。比较正常的情况是2周～4周。如细菌在含硫化铜的培养基中培养，一般要2周～4周方可适应，如果细菌的养料不变，则转移当中的的缓慢期就很短，甚至没有缓慢期。在缓慢期之后，随着细菌对环境的适应，开始进入对数生长期。这个时期细菌生长非常活跃，以对数增长的速度繁殖，此时细胞数目大量增加，对数生长期的曲线斜率就是细菌生长率μ：dtnddtdnn)(log1（12-1）式中，n----细菌浓度（个/ml）；t----培养时间（d或h）。这个时期细菌也死亡，但新增加的细菌数目远超过死亡的细菌数。图12-2微生物生长曲线在对数生长期之后，细菌进入稳定生长期，此时细菌死亡数目和新生数目大致相等，所以总的细菌数维持恒定。这个时期培养器内细菌的绝对数是最多的。但此时培养基中营养大量消耗，细菌已变得