引物设计心得、Primer5.0 使用

引物设计、选择核酸内切酶、酶切位点之Primer5.0使用下面以目的基因CD63为例，介绍一下真核表达载体PcDNA3.1(+)-CD63的构建过程1cd63基因序列的获取打开NCBI-选择输入cd63回车找到第16条编码为1的打开后可见该积基因的详细信息，找到CDS（编码序列）可见其编码序列为第146到862位碱基，继续往下拉，可见基因序列，选中编码序列（146-862）复制，打开Primer5.0（起始密码子）ATGgcggtggaaggaggaatgaagtgtgtcaagtt181tttgctctacgttctcctgctggccttctgcgcctgtgcagtgggattgatcgccattgg241tgtagcggttcaggttgtcttgaagcaggccattacccatgagactactgctggctcgct301gttgcctgtggtcatcattgcagtgggtgccttcctcttcctggtggcctttgtgggctg361ctgtggggcctgcaaggagaactactgtctcatgattacatttgccatcttcctgtctct421tatcatgcttgtggaggtggctgtggccattgctggctatgtgtttagagaccaggtgaa481gtcagagtttaataaaagcttccagcagcagatgcagaattaccttaaagacaacaaaac541agccactattttggacaaattgcagaaagaaaataactgctgtggagcttctaactacac601agactgggaaaacatccccggcatggccaaggacagagtccccgattcttgctgcatcaa661cataactgtgggctgtgggaatgatttcaaggaatccactatccatacccagggctgcgt721ggagactatagcaatatggctaaggaagaacatactgctggtggctgcagcggccctggg781cattgcttttgtggaggtcttgggaattatcttctcctgctgtctggtgaagagtattcg841aagtggctatgaagtaatgtag其中tag（（UAG）终止密码子，设计引物的时候需要将其删除，因为，真核表达载体上多含有标签序列，目的基因与载体链接后，在目的基因的下游即为标签序列，如果不去除上述终止密码子，则目的基因转录的时候就会在此终止，标签序列就不会得到表达，为后续帅选阳性克隆等实验带来困难！点击file-new-DNAsequence-将编码序列复制（ctrlV）选择Asis2限制性内切酶的选择通过查看PcDNA3.1（+）载体图谱，选择合适的内切酶，筛选的标准是，目的基因序列内不存在该酶的酶切位点，以及选择实验室内常用的已有的酶。另外pcDNA3.1（+），和（-）的含义是都是多克隆载体，只是多克隆位点区有差异，应用都是一样的，都可以做真核表达我们可知载体上存在这些酶切位点结合本实验室拥有哪些常用的酶选择合适的两个酶科技楼常用BamHI、XhoI、HindIII、EcoRI、PstI、BgiII这几种酶，所以尽量选择这几种，以便省去买那些不常用的酶，造成浪费下面看点击Enzyme，将刚才我们列出的几种酶从左面导入到右面，点击OK出现PstI这种酶在目的基因内部第625个碱基出存在酶切位点，则该酶不能使用，我们可以从BamHI、XhoI、HindIII、EcoRI、BgiII中选择两个，两个酶切位点之间相距不要太近，以免因为空间位阻影响酶的切割效率，上图左边为上游酶切位点，右面为下游酶切位点，上下游各选择一个，故我们可以选择HindIII和XhoI、BamHI和XhoI、HindIII和XhoI几种组合，又因为每种酶发挥效能时需要合适的液体环境，即Buffer，我们尽量选择两种酶都能正常使用的Buffer，见下表：我们选择了HindIII和XhoI，查表可知应选用1×MBuffer这样酶切位点和酶，buffer都选好了，下面开始设计引物3引物设计点击Primer-左上角file-preferences可以选择引物的长度，一般是18-26个碱基，我们可以从18开始，逐渐试，以选出最优引物长度S代表上游引物，序列和目的基因5’端碱基序列一样，图中显示对18个碱基的上虞噢引物的评价，里面有多个指标以评价引物质量，全是None的时候最好，如果不能满足，则至少要让FalsePrimering这一项是None，如果都无法满足，则只能凑合用了，接下来可以设定19个、20个….碱基的长度，不一一列举了。这样我们选择的上游引物长18bp，点击EditPrimers，可以将引物序列复制出来5’ATGGCGGTGGAAGGAGGA-3’设计下游引物，点击A将滚动条拖到最右端，设定长度，再选择，结合评价选择合适的下游引物我们选择20bp，点击EditPrimers，可以将引物序列复制出来5-CATTACTTCATAGCCACTTC-3下游引物其实就是目的基因序列从3’端开始的20个碱基的反向互补序列（具体可以参照基因序列自己体会）引入酶切位点和保护性碱基（酶作用时形成粘性末端，故需在酶切位点的5’端加上几个保护性碱基，以使酶正常发挥作用）常见酶切位点和保护性碱基酶寡核苷酸序列链长切割率%2hr20hrAccIGGTCGACCCGGTCGACCGCCGGTCGACCGG81012000000AflIIICACATGTGCCACATGTGGCCCACATGTGGG810120909009090AscIGGCGCGCCAGGCGCGCCTTTGGCGCGCCAA81012909090909090AvaICCCCGGGGCCCCCGGGGGTCCCCCGGGGGA81012509090909090BamHICGGATCCGCGGGATCCCGCGCGGATCCGCG81012109090259090BglIICAGATCTGGAAGATCTTCGGAAGATCTTCC810120752509090BssHIIGGCGCGCCAGGCGCGCCTTTGGCGCGCCAA8101200500090BstEIIGGGT(A/T)ACCC9010BstXIAACTGCAGAACCAATGCATTGGAAAACTGCAGCCAATGCATTGGAACTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT2224270252505090ClaICATCGATGGATCGATCCCATCGATGGCCCATCGATGGG881012009050009050EcoRIGGAATTCCCGGAATTCCGCCGGAATTCCGG81012909090909090HaeIIIGGGGCCCCAGCGGCCGCTTTGCGGCCGCAA81012909090909090HindIIICAAGCTTGCCAAGCTTGGCCCAAGCTTGGG8101200100075KpnIGGGTACCCGGGGTACCCCCGGGGTACCCCG810120909009090MluIGACGCGTCCGACGCGTCG810025050NcoICCCATGGGCATGCCATGGCATG814050075NdeICCATATGGCCCATATGGGCGCCATATGGCGGGGTTTCATATGAAACCCGGAATTCCATATGGAATTCCGGGAATTCCATATGGAATTCCC810121820220000757500009090NheIGGCTAGCCCGGCTAGCCGCTAGCTAGCTAG810120101002550NotITTGCGGCCGCAAATTTGCGGCCGCTTTAAAATATGCGGCCGCTATAAAATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATAAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA1216202428010102525010109090NsiITGCATGCATGCACCAATGCATTGGTTCTGCAGTT122210909090PacITTAATTAAGTTAATTAACCCTTAATTAAGG8101200002590PmeIGTTTAAACGGTTTAAACCGGGTTTAAACCCAGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG8101224000750255090PstIGCTGCAGCTGCACTGCAGTGCAAACTGCAGAACCAATGCATTGGAAAACTGCAGCCAATGCATTGGAACTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT8142224260109090001090900PvuICCGATCGGATCGATCGATTCGCGATCGCGA81012010002510SacICGAGCTCG81010SacIIGCCGCGGCTCCCCGCGGGGA812050090SalIGTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGCGCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGGACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA2830320101005075ScaIGAGTACTCAAAAGTACTTTT81210752575SmaICCCGGGCCCCGGGGCCCCCGGGGGTCCCCCGGGGGA68101200109010105090SpeIGACTAGTCGGACTAGTCCCGGACTAGTCCGCTAGACTAGTCTAG810121410100090905050SphIGGCATGCCCATGCATGCATGACATGCATGCATGT81214001002550StuIAAGGCCTTGAAGGCCTTCAAAAGGCCTTTT81012909090909090XbaICTCTAGAGGCTCTAGAGCTGCTCTAGAGCACTAGTCTAGACTAG810121409075750909090XhoICCTCGAGGCCCTCGAGGGCCGCTCGAGCGG810120101002575XmaICCCCGGGGCCCCCGGGGGCCCCCCGGGGGGTCCCCCCGGGGGGA810121402550900759090则引入酶切位点后的引物序列为上游引物CD63-F5’-CCCAAGCTTGCCACCATGGCGGTGGAAGGAGGA-3CCC为保护性碱基，蓝色字体为HindIII酶切位点，在酶切位点后引入kozak序列（kozak序列存在于真核生物mRNA的一段序列,其在翻译的起始中有重要作用。核糖体能够识别mRNA上的这段序列,并把它作为翻译起始位点，GCCACC与后面ATG形成为kozak序列下游引物CD63-R：5-CCGCTCGAGCATTACTTCATAGCCACTTC-3这样我们就设计好了目的基因扩增所需的上下游引物以及为后续构建重组质粒所需的酶切位点。下一步，PCR扩增目的基因，扩增体系，程序见前期发的心得，扩增产物经琼脂糖电泳分离，DNA胶回收试剂盒回收目的片段分别对目的片段和pcDNA3.1空载体行Hindiii、XhoI双酶切，琼脂糖电泳分离酶切后的片段，将双酶切后的载体和目的基因连接，连接产物转化BL21，涂板，如图pcDNA3.1具有Amp+抗性，加入氨苄筛选阳性克隆，挑菌，扩大培养，抽提质粒，对质粒双酶切鉴定，以确定是否含有目的基因，如有，1ml菌液送生物公司测序，如果测序结果和已知基因序列一致，则获得成功构建的重组真核表达载体pcDNA3.1（+）-CD63写完了，希望大家能看懂，并对当前试验有较深的理解，以及整个试验流程有个简单的认识，现在大家对所做的提质粒什么的不知道为何、有什么