新鲜实体组织单细胞悬液制备

流式细胞术对细胞的各种参数分析必须基于单细胞的基础上，根据不同实体组织成分的特点可选择不同的分散细胞的方法，以期达到单细胞产量高、细胞损伤小的目的。在实体组织分散为单细胞的过程中，解离的方法有可能瞬间或持久地影响细胞的性质，比如，形态上显而易见的细胞膜破损，细胞表面上可出现泡状特征，还有一些是难以观察到的线粒体活性的变化、选择性膜表面抗原的丢失、蛋白质的丢失等，细胞受损程度受温度、pH值、处理时间等多种因素的影响。机械性或人工制备的单细胞，在某些性质上很可能已改变了原组织细胞特性，因此处理不同组织时，努力摸索方法，尽可能采用对细胞损伤小，产率较高的单细胞悬液制备方法，最大限度地保持细胞原有特性。下面介绍几种细胞悬液制备方法，仅供参考。（一）酶消化法酶的作用原理主要有三方面：一是破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等，二是水解组织细胞的紧密连接结构的蛋白质，三是水解组织粘多糖物质。酶消化法是实体组织分散为单细胞的主要方法之一。常用的酶类有：胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、溶菌酶、弹性蛋白酶等。可根据分散的组织类型确定使用的酶类。需要注意的是使用条件和影响因素（酶浓度、酶效价、作用时间、pH值）等，如胃蛋白酶在碱性环境下失去活性，胰酶在中性溶液中活性欠佳。酶消化法常规程序如下：1、将适合于酶消化的组织置于离心管中。2、将选好的酶溶液1～2ml加入盛有被消化组织的试管中。3、常规消化20～30min（恒温37℃或室温），消化期间间断振荡或吹打。4、终止消化，收集细胞悬液，以300目尼龙网过滤，除去细胞，以低速离心除去细胞碎片。5、加入PBS2ml充分混匀，离心弃掉上清。再加入0.5mlPBS重悬细胞。6、将制备好的单细胞悬液进行荧光标记后上机检测或保存备用。（二）机械法机械法分散实体组织包括：用剪刀剪碎组织或用锋利的解剖刀剁碎组织，用匀浆器匀浆，用线注射针头反复抽吸细胞等，最后用300目尼龙网过滤细胞得到单细胞悬液。1、剪碎法（1）将组织块放入平皿中，加入少量生理盐水。（2）用剪刀将组织剪至匀浆状。（3）加入10ml生理盐水。（4）用吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管内。（5）离心沉淀1000rpm/min，4～5min，再用生理盐水洗3次，每次以短时低速（500～800rpm/min）离心沉淀去除细胞碎片。（6）以300目尼龙网过滤去除细胞。（7）选择适当的固定液（70％冰乙醇等）固定细胞或低温保存备用。2、网搓法（1）将100目、300目尼龙网扎在小烧杯上。（2）把剪碎的组织放在网上，用眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边用生理盐水冲洗，直到将组织搓完。（3）收集细胞悬液，离心沉淀细胞500～800rpm/min，2分钟。（4）固定细胞或低温保存备用。3、研磨法（1）先将组织剪碎成1～2mm3小块。（2）放入组织研磨器中加入1～2ml生理盐水。（3）转动研棒，研至匀浆。（4）加入10ml生理盐水，冲洗研磨器。（5）收集细胞悬液，并经300目尼龙网过滤，离心沉淀细胞，500～800rpm/min，2分钟，再用生理盐水洗3遍，离心沉淀。（6）固定或低温保存细胞，备用。（三）化学处理法化学处理法的主要原理是：将组织细胞间起粘连作用的钙、镁离子置换出来，从而使细胞分散下来。1、试剂配制（1）0.2％EDTA配制：将0.2gEDTA溶解于100mlHank液中，封装高压消毒，置0～4℃保存。（2）胰酶加EDTA配制：胰酶0.25g加PBS（pH7.0）200ml，浓度为0.125％，EDTA0.2g加PBS（pH7.0）100ml，浓度为0.2％。各取40ml混合，分装后置0～4℃冰箱保存，使用前过滤即可使用。2、实验方法（1）将组织切成薄片，置于试管。（2）首先加入EDTA液5ml，室温下0.5小时，离心弃之。（3）加入胰酶－EDTA液5～10ml，置37℃恒温水浴30min，间断振荡3～5次。（4）用300目尼龙网过滤，离心沉淀1000rpm/min，5分钟。再以生理盐水洗2～3次，离心500～800rpm，1～2分钟。（5）将细胞固定或低温保存备用。化学处理法获得的细胞存活率低，细胞产量较低，细胞碎片和细胞聚集量不稳定。