鸡胚接种技术

第二章鸡胚接种技术一、概况1911年Rous和Murphy首先应用鸡胚培养研究肉瘤病毒(Rous肉瘤)的繁殖。1938年Goodpasture和Burnet等应用鸡胚繁殖病毒、Cox应用卵黄囊培养立克次体。鸡胚培养法的优点：鸡胚的组织分化程度低，可选择适当途径接种，病毒易复制，感染病毒的膜和液体含大量病毒。鸡胚是一整体，有神经血管的分布及脏器的构造。来源充足，操作简单，通常是无菌的，对接种的病毒不产生抗体。鸡胚培养法的缺点：一般的病毒通常不使鸡胚产生特异性的感染指征。卵黄中常常含有抗家禽病原体的母体抗体。某些细菌、衣原体和病毒能够从感染的母鸡传递到鸡胚。通常鸡胚含有白血病病毒。在鸡食物中加入抗菌素，母鸡吃后会传递给鸡胚，鸡胚就会产生对立克次体和衣原体感染的抵抗。第一节鸡胚的结构与生理鸡胚是由三个胚层发育起来的，即外胚层、中胚层和内胚层，它们构成胚胎的组织与器官。（约10日龄鸡胚的结构见图）卵壳与壳膜卵壳位于最外层的坚硬壳层；壳膜位于卵壳的下层，允许气体和液体分子交换，因此培养鸡胚需一定的湿度和气体。气室功能主要是呼吸和调节压力。绒毛尿囊膜壳膜之下，主要是胚胎的呼吸器官。羊膜胚胎的最内层包被，含羊水，胚胎在其中。尿囊腔位于绒毛尿囊腔和羊膜之间，胚胎排泄器官含5－20ml尿囊液，含大量的尿酸盐，为减少沉淀，盐水稀释再4℃保存。卵黄囊主要营养的储藏场所，为胚胎提供营养。卵白外于卵的锐端，为胚胎发育晚期提供营养。第二节鸡胚的孵育和检查受精鸡卵的供给—没有受到病毒和细菌的污染如新城鸡瘟病毒、布氏杆菌等；—培养立克次体和衣原体，不能来自食用抗生素的鸡群。鸡胚的孵育—温度为38～39℃；—湿度为40％-70％；—翻蛋：防止蛋白粘连，促进羊膜运动和空气流通；—通风：排出CO2和吸入O2。检卵—血管：活胚可见清晰的血管，有时可见血管搏动，死胚血管模糊成淤血带或淤血块。—胎动：活胚可见明显的自然运动，尤其在转动胚胎时，死胚见不到任何胎动，胚胎发红像出血样，有的呈现黑块。—绒毛尿囊膜发育界限：发育好的鸡胚可见密布丰满的血管网，也就是绒毛尿囊膜，死胚则见不到这一现象。第三节鸡胚接种途径及方法（一）羊膜腔接种应用于从临床材料中分离流感病毒等，病毒感染后可收集羊水和尿囊液。接种步骤与方法将10~12日龄的鸡胚在检卵灯上照视，标记气室及胚胎的位置。消毒气室部位的蛋壳，在气室顶端钻出一约10mm×6mm的长方形裂痕，注意勿钻破壳膜。再次消毒钻孔区后，用灭菌的小镊子除去长方形卵壳和外层壳膜，并滴加灭菌液体石蜡一滴于下层壳膜上，使其透明，以便观察胚胎的位置。将注射器刺向胚胎的腭下胸前，以针头拨动下颚及腿，当进入羊膜腔内时，可看到鸡胚随针头的拨动而动，此时可注入O.1～0.2ml病毒液。拔出针头，孔区消毒后用沾有碘酒通过火焰的小块胶布将卵壳的窗口封住，于33～35℃孵育48～72h，要保持鸡胚钝端朝上。羊膜腔接种法解剖与收获收获前鸡胚须置4℃冰箱6h或过夜，但不能放置时间过长(过长会引起散黄)。如急于收获亦可置-20℃冰箱lh左右。预冷的目的是，将鸡胚冻死，使血液凝固，避免收获时流出红细胞，并同尿囊液的病毒发生凝集，造成病毒滴度下降。病毒通过胚胎机体后被排泄入尿囊腔，因此当羊水过少时，可用同胚少量尿囊液冲洗羊膜腔并吸取该洗液。（二）绒毛尿囊膜接种常用于牛痘病毒、天花病毒、单纯疱疹病毒的分离，因为这些病毒在绒毛尿囊膜上可形成肉眼可见的斑点状或痘疱状病灶。另外，病毒可在绒毛尿囊膜上进行滴定，因为感染性病毒颗粒的数目可以通过产生的斑和痘的数目来计算。该方法还可用于抗病毒血清的滴定试验，即在有抗体存在的情况下，痘疱形成受到抑制。将孵育l0~13日龄的鸡胚标记气室、胎位，于与胚胎略近气室端卵壳上划一等边三角形。消毒气室顶端及记号处，用开孔器在记号处的卵壳上开一三角形裂痕，不可弄破下面的壳膜，同时在气室顶端钻一小孔。轻轻揭去卵壳，露出壳膜，在壳膜上滴一滴生理盐水，用针尖循卵壳膜纤维方向划破一隙，勿伤及紧贴的绒毛尿囊膜。用针尖刺破气室小孔处的壳膜，再用橡皮乳头紧按气室小孔向外吸气，此时盐水小滴即可自裂隙流至绒毛尿囊膜上，从而使绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室。在卵壳的窗口滴0.05~0.1ml病毒液于绒毛尿囊膜上，然后将旋转鸡胚使接种物扩散到整个绒毛膜尿囊膜上。在卵壳的窗口周围涂石蜡，用消毒胶布封口。将鸡胚保持人工气室在上的位置，33~35℃继续培养48～72h。接种步骤与方法绒毛尿囊膜接种法解剖与收获用剪刀沿人工气室边缘将膜剪下，放入加有灭菌生理盐水的培养皿内，观察病灶形状或用于传代，或用50％甘油保存。同时作无菌培养。（三）尿囊腔接种广泛应用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的适应和传代培养，这些病毒被接种到尿囊腔后，可在内皮细胞中复制，复制的病毒被释放到尿囊液中，因此，在尿囊液中含有大量的病毒。取9~11日龄的鸡胚，标记气室与胚胎位置，并在胚胎面与气室交界之边缘上约1mm处避开血管作一标记，此即为注射点。将鸡胚竖放在卵杯上，钝端向上。消毒气室的蛋壳，用开孔器钻开一长约2mm小口。再次消毒钻孔区，接种病毒液0.1～0.2ml，将针头刺入孔内，经尿囊膜入尿囊腔，注入病毒液。消毒后用石蜡溶化封孔，于33～35℃孵卵器孵育48～72h，；于接种后24h内死亡者为非特异性死胚应弃去。接种步骤与方法尿囊腔接种法解剖与收获接种后收获病毒的时间根据不同病毒而异，甲型流感病毒一般培养44～48h，乙型流感病毒培养72h。收获前鸡胚置4℃冰箱6h或过夜，但不能放置时间过长。消毒气室的卵壳，用灭菌剪刀剪去气室部的卵壳，用无菌镊子撕去气室部壳膜，并翻开到卵壳边上。将鸡卵倾向胚胎一侧，用灭菌毛细吸管通过绒毛尿囊膜进入尿囊腔，吸出尿囊液。一般一个鸡胚可收获5～10ml的尿囊液。若操作时损伤了血管，则病毒会吸附在红细胞上，尿囊液则无。经无菌试验后，可在4℃或低温保存。（四）卵黄囊接种主要用于虫媒病毒、衣原体及立克次体等的分离和繁殖。这些大的病原体主要在卵黄囊的内皮细胞生长，且生长速度很快，立克次体染色后也可看到。取5～8日龄鸡胚，标记气室和胚胎位置，垂直放置在卵架上，钝端朝上，消毒气室端。用开孔器在气室中央的卵壳上钻一小孔，用带有6号针头的1m1注射器将样品从小孔处沿胚的纵轴迅速刺入约3cm，注入0.2～0.5ml待接种的病毒于卵黄囊内，随后用胶带或溶化的石蜡封孔。置孵化箱内继续孵育3～8d，时间长短应根据病毒或立克次体的种类而定，每天翻卵2次，弃掉24h内死亡的鸡胚(但东方型和西方型马脑炎可能在接种后15～24h内死亡)。接种步骤与方法卵黄囊接种法解剖与收获收获时，鸡卵预冷，消毒气室端的卵壳，剪掉卵壳，除去壳膜后，用镊子将卵黄囊与绒毛尿囊膜分开。夹出卵黄囊放在灭菌平皿中，必要时用生理盐水冲去卵黄。也可将全部内容物倾入平皿中，然后剥出卵黄囊。将不带卵黄的膜放在无菌平皿或烧杯中，以便用于染色检查或进行传代。对某些病毒的分离则要收集全部胚体。三、注意事项防止污染：鸡胚为一活的有机体，因此要严格无菌操作。动作要仔细，以免造成物理死亡。接种后24小时内死亡应不计结果。适宜的培养温度：第四节病毒的检测无菌试验—目的:证实收集的鸡胚是否受到细菌的污染。—方法:收集鸡胚组织接种肉汤培养；37℃培养36h；肉汤清亮则无污染,肉汤浑浊或有菌落,说明鸡胚被细菌污染。直接观察法—在绒毛尿囊腔形成损害或疱疹:如痘类病毒和疱疹病毒,常产生白色或灰色痘疱,并有充血；—引起鸡胚死亡:如新城疫病毒、乙脑病毒；—造成鸡胚损害和胚胎生长迟缓：马流感病毒。实验检测法—血凝试验和血凝抑制试验：流感病毒的存在；—补体结合试验：腮腺炎病毒；—其他方法：PCR等。检测方法第五节鸡胚接种技术的应用病毒的培养、分离与鉴定•流感病毒的分离和鉴定•禽流感病毒的分离和鉴定•其他病毒的分离和鉴定疫苗的研制活疫苗和死疫苗第三章动物试验技术实验动物(experimentalanimals)：是指经人工饲养，遗传背景明确、来源清楚，控制其携带的微生物，用于科学研究、教学、生产、鉴定以及其它科学实验的所有动物。第一节实验动物的种类和基本操作方法一、实验动物的种类（微生物控制分类）普通动物(conventionalanimals，CV)：称一级动物，是微生物控制要求最低级别的实验动物，要求不携带动物烈性传染病和人兽共患病病原。一般仅供教学示范及作为预备试验之用。清洁动物(cleananimals，CL)：称二级动物，除不携带普通动物病原体外，要求不携带对动物危害大、对实验干扰大的病原体。无特定病原体动物(specificpathogenfreeanimals，SPF)：又称三级动物，除普通动物、清洁动物不得携带的病原外，还要求排除潜在感染或条件致病菌的感染。是目前国际公认的标准级别的实验动物，适合于作所有科研实验。无菌动物(germfreeanimals，GF)和悉生动物(gnotobioticanimals，GN)：为四级动物。无菌动物要求在体内外不得检出其他的生命体。悉生动物又称已知菌动物，是将已知菌植入无菌动物体内。实验动物的遗传学控制分类近交系(inbredstrain)：是指经过连续20代以上全同胞或亲子交配培育的动物品系。特点有:基因型相同，表现型一致；对外来刺激反应一致；实验结果重复性好，可比性强。封闭群(closedcolony)：是指一个不从外界引入新的血缘，非近亲交配方式繁殖一定代次的实验动物群体。特点是群体遗传特异性相对稳定，个体间具有杂合性，存在一定差异。突变系(mutantstrain)：是指由于遗传基因发生突变而具有某些特殊性状的动物，如肥胖症小鼠、糖尿病小鼠等。实验动物的遗传学控制分类杂交群动物(hybridanimal)：又称异系杂交，是由不同的品系杂交所产生的后代。由两个近交系之间交配产生的动物称为杂交一代，其遗传和表型均一性好，生命力、适应力和抗病力较近交系动物强，实验结果重复性好，适应实验范围更大。转基因动物(transgenicanimals)与基因缺陷动物：将外源性基因插入生殖细胞基因组并能正常繁衍的动物称为转基因动物。另外，还可以采用基因剔除技术构建基因缺陷动物，通过删减单一基因或相关基因组，研究基因的功能。二、常用的实验动物小鼠：昆明小鼠、BALB/c小鼠、裸鼠、SCID小鼠；豚鼠：制备抗体和补体以及提供红细胞。家兔：三、实验动物常用基本操作技术实验动物的捕捉和固定：实验动物编号和分组：实验动物的麻醉方法：乙醚吸入法是最常用的方法。•皮下接种：多用于观察动物病毒感染后的免疫学指标。•腹腔接种：大小鼠接种多用此方法。可用于病毒感染及感染后免疫指征的观察，或作为抗病毒的给药途径。•静脉接种：可造成病毒全身性感染，可观察病毒的致病性或机体对病毒的清除机制。小鼠、大鼠采用尾静脉注射。豚鼠采用前肢皮下静脉注射。兔采用外耳缘静脉注射。接种途径和接种方法•消化道接种：用于分离腹泻病毒或由消化道感染病毒研究。•鼻腔接种法：将接种物滴入动物鼻腔，接种量小鼠0.03～0.05ml，大鼠0.05～O.1ml。•颅内接种法：将临床标本或特定的病毒直接接种于动物脑内，使动物形成实验性中枢神经系统感染。•角膜接种法:细针尖轻划角膜，划痕与眼裂平行，约三道。接种液滴加2～3滴，接种后48～72h观察结果。实验标本的采集采血方法脑脊液的采集尿液的采集腹水的采集四、使用实验动物的基本原则研究目的明确：—探讨疾病的发病机制和复制动物模型；—制备诊断抗原、抗体及疫苗；—监测诊断抗原、抗体及疫苗的安全性、有效性。动物选择原则：使用顺序：小鼠、大鼠、兔、犬、猴、人。使用实验动物的3Rs原则：replace(替代）、reduction(减少）、refinement(优化）的原则。第二节动物实验在病毒检验中的应用动物实验在病毒分离中的应用—确定疾病的病因；—使病毒增殖，提高临床检出率；—