蛋白质结构的研究技术

蛋白质结构的研究技术•1.X射线单晶衍射分析技术•2.核磁共振技术•3.蛋白质的二维结晶及三维重构技术•4.蛋白质溶液构象的光谱技术•5.扫描探针显微镜技术•6.交联质谱技术•7.分子模拟技术X射线单晶衍射技术的原理当一束X射线照射到晶体上时，X射线在晶体中产生衍射现象。晶体所产生的衍射花样都反映出晶体内部的原子分布规律。X-衍射技术的原理•若用照相法收集衍射线，则可使胶片感光，留下相应的衍射花样(衍射光斑、衍射光环或衍射线条)。•X射线晶体衍射分析（X－rayCrystallography）主要包括以下五个步骤：1）晶体培养2）数据收集和处理3）测定相位4）电子密度图的计算和解释5）结构模型修正•1）晶体培养。结构测定的精度依赖于晶体所能达到的衍射分辨率，所以获得具有强衍射能力的晶体是蛋白质晶体结构测定分析的关键步骤，是蛋白质晶体结构分析的瓶颈。•2）数据收集和处理一般来讲，中等大小晶胞的一套高分辨率数据，至少要收集几万个衍射强度数据，再经过专门的数据处理程序包处理，给出这一套数据的各种统计结果，以判断数据质量的好坏。•3）电子密度图的计算和解释有了每个衍射点的相位，加上已经收集到的每个衍射点的结构振幅，就可计算电子密度图。由于蛋白质分子结构的复杂性，它的电子密度图随着分辨率的不同，从图上能识别出的结构层次也不同。•4）结构模型修正从电子密度图上最初建立的蛋白质分子结构模型是比较粗糙的，需要进一步精华。X-衍射技术在蛋白质研究中的应用•英国生物化学家肯德鲁（JohnCowderyKendrew）和佩鲁兹（MaxFerdinandPerutz），用X-射线衍射分析法研究血红蛋白和肌红蛋白，而且共同研究X-射线衍射晶体照相术，以及蛋白质和核酸的结构与功能。•1960年，他们把一些蛋白质分子和衍射X-射线效率特别高的大质量原子（如金或汞的原子）结合起来，首次精确地测定了蛋白质晶体的结构。肯德鲁和佩鲁茨分享了1962年的诺贝尔化学奖。X-衍射技术在蛋白质研究中的应用•莱纳斯.鲍林（LinusCarlPauling）将X-射线衍射晶体结构测试的方法引入到蛋白质结构测定中，并且推导了经衍射图谱计算蛋白质中重原子坐标的公式。至今，通过蛋白质结晶进行X-射线衍射实验仍然是测定蛋白质三级结构的主要方法，人类已知结构的绝大部分蛋白质都是经由这种方法测定获得的。•结合血红蛋白的晶体衍射图谱，鲍林提出蛋白质中的肽链在空间中是呈螺旋形排列的，这是最早的α螺旋结构模型。X-衍射技术在蛋白质研究中的应用•2000年，美国科学家阿格雷（PeterAgre）与其他研究人员应用场发射电子源的电子衍射方法得到分辨率为3.8埃的AQPl水通道电子密度图，发现了一种被称为水通道蛋白的细胞膜蛋白就是人们寻找已久的水通道，并公布了世界第一张水通道蛋白的高清晰度立体照片。•阿格雷和麦金农因为对膜蛋白分子和离子通道开创性的研究，而共同分享了2003年的诺贝尔化学奖。核磁共振技术•核磁矩不为零的核在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼分裂，共振吸收某一特定频率的射频（RF）辐射，这一物理过程就是核磁共振。满足共振条件可以有两种方法•一是固定电磁波的频率而逐渐改变外加磁场，称为扫场•另一种是固定磁场而改变电磁波的频率，称为扫频。•目前应用最广的是脉冲傅立叶变换的核磁共振技术。即应用一个短时间方波脉冲激发样品，这种方波中包含各种不同的频率在内，因此样品中不同的核可在同一时间内都得到激发。但是脉冲过后得到的是指数衰减的时域函数，借助Fourier变换的数学方法把时域函数转换成频域函数，这时就能见到已经产生的若干共振峰，这种变化过程可以由计算机自动完成。•一维核磁共振只能测定小分子的结构如氨基酸，要测定大分子物质就需要利用二维核磁共振以及多维核磁共振。•一维核磁共振是在一个脉冲之后的t1时间进行数据收集•二维核磁共振在t1时间后再加一个脉冲后在t2时间内收集数据S（t1，t2），然后分别以t2和t1为变量进行傅立叶变换就得到二维谱S（w1，w2）。二维谱就是把作为对角线的一维谱的峰进一步分开。核磁共振应用于测定蛋白质三维结构•950年，Proctor等人研究发现：质子的共振频率与其结构（化学环境）有关。在高分辨率下，吸收峰产生化学位移和裂分，由有机化合物的核磁共振图，可获得质子所处化学环境的信息，进一步确定化合物结构•1971年，比利时科学家J.Jeener提出二维核磁共振的概念•1985年，KurtWüthrich在此基础上发明了一种新的方法，他选择生物大分子中的质子(氢原子核)作为测量对象，连续测定所有相邻的两个质子之间的距离和方位，这些数据经计算机处理后就可形成生物大分子的三维结构图•核磁共振技术的优点：具有高分辨率，仅次于X-射线晶体学技术，可以在溶液中操作，在近似蛋白质生理环境下测定其结构，甚至可以对活细胞中的蛋白质进行分析，获得“活”的蛋白质结构。缺点：所能测定的样品的分子量要比较小，一般在50KD以下。另外核磁共振衍射技术的反应体系是溶液，这对不溶的蛋白比较困难，如膜蛋白，只有用去垢剂才能溶解，这就使研究复杂化。在核磁共振衍射的观察中，去垢剂会造成很大的噪音和假相。实验周期较长，采用核磁共振方法寻找蛋白质结构较为耗费人力及时间，尤其是图谱分析工作极为困难和费时。蛋白质三维电镜重构技术•在电镜下观察生物大分子时，观察的对象是三维结构，电镜图像是这些三维结构的二维投影。由生物结构的二维电镜图像推知其三维结构的方法称为三维电镜方法•三维电镜技术的新进展：冷冻电子显微镜技术冷冻电镜三维重构是结构生物学研究中的一种较新的技术。它的基本技术路线为：利用快速冷冻技术对样品进行冷冻固定，然后利用冷冻电镜和低剂量成像技术对样品进行电子成像，利用高灵敏底片进行成像记录，利用高分辨率扫描仪对底片进行数字化，对数字化的图像进行二维图像分析——选点、分类、校正和平均，最后完成样品的三维重构计算。•相对于其他两种成熟的结构生物学研究手段——X射线晶体学和核磁共振技术,主要有以下一些优势：•1）可以直接获得分子的形貌信息，即使在较低分辨率下，电子显微学也可给出有意义的结构信息；•2）适于解析那些不适合应用X射线晶体学和核磁共振技术进行分析的样品，如难以结晶的膜蛋白，大分子复合体等；•3）适于捕捉动态结构变化信息；•4）易同其他技术相结合得到分子复合体的高分辨率的结构信息；•5）电镜图像中包含相位信息，所以在相位确定上要比X射线晶体学直接和方便。•三维电镜重构技术的缺点：由于生物样品易受辐照损伤、图像衬度低、信噪比低的特点，它对生物大分子的高分辨率结构解析非常困难。蟑螂浓核病毒通过冷冻电子显微镜技术进行的病毒衣壳空间结构的三维重构分析蛋白质溶液构象的光谱技术•1.同步辐射圆二色光谱（SRCD）研究蛋白质结构采用同步辐射光源，可以将测定波长低至160nm，从而提供低波长的信息。而且，SRCD的真空紫外辐射不破坏蛋白质短的整体性，并且有高的信噪比，更快的测量等特点，在高浓度缓冲液和其它吸附成分存在时仍可以完成样品的检测。•2.紫外共振拉曼光谱和二维相关红外光谱共振拉曼光谱是在吸收区选择激发样品，在紫外区选择激发蛋白质分子的不同区域，开展蛋白质结构的研究工作，很大程度地提高了拉曼散射截面，排除了荧光干扰，使光谱的信噪比显著提高。二维相关红外光谱作为一种新的分析技术被用来分析蛋白质的酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ带。此技术非常有用，因为二维相关红外光谱能够按不同的二级结构将酰胺带去卷积成各成分带；能够给予一个扰动，通过选择性的相关峰，将不同的二级结构关联；能够提供各种环境下，二级结构变化和氨基酸残基变化的特有规律。扫描探针显微镜（SPM）技术•SPM家族通常分为扫描隧道显微镜（STM）和原子力显微镜(AFM)两大类。其成像及工作原理分别是检测针尖和样品之间的隧穿电流和相互作用力。•SPM具有很高的空间分辨率，可以原位实时成像，并且可以在一定条件下成原子级像。蛋白质分子由于必须依靠一定的媒介环境才能保持其生物活性和化学活性，因而蛋白质的成像通常是在特定的缓冲液中