拟南芥干旱胁迫的分子和生理分析揭示了植物生长对环境适应的初期反应

1.题目：拟南芥干旱胁迫的分子和生理分析揭示了植物生长对环境适应的初期反应2.背景知识：对由土壤水分亏缺引起的干旱，植物会表现出一系列的抗旱机制，进一步把这些抵抗行为分为干旱逃避和耐干旱两种。干旱逃避是植物整个生长发育过程不与干旱相遇逃避干旱危害，即在干旱来临前完成生命周期的能力；或植物具有防御干旱的能力，以抵御干旱对植物的有害影响，使植物在干旱下仍能维持正常的生理状态（逆境排外）。耐干旱是在植物组织低水势下抵抗水分亏缺的能力，植物可以通过代谢反应阻止、降低或修复由逆境造成的损伤，使其在逆境下仍保持正常的生理活动。3.用来检验植物的耐受性和抗性反应的干旱处理方法有很多种：累积干旱（pDr）即水分被抑制一段时间直到可以观察到萎焉症.这种干旱处理方法通常用来确定存活率或检测基因表达的变化。然而，累积干旱（pDr）处理的一个缺点是，由于土壤水分湿度不能控制，它不能用来比较不同生长特性下不同基因型的行为功能。为了模拟田间条件和量化干旱反应，可以利用以下方法：可控制的干旱处理，就是使植物处于土壤水分亏缺的恒定水平，对植物非致死干旱反应的基因型和生态型进行评估。4.材料与方法1.生长条件和干旱处理将拟南芥生态型（哥伦比亚）种子播于湿润的泥炭团中，分层的在4℃放置2天，然后转移至22℃10小时光照(100μmolem-2s-1)的培养室里。实验的最开始，对做干旱处理的泥炭团在播种之前进行称重以确定泥炭团里的水分含量。可控制的中等干旱条件(mDr)是给植物田间持水量的30%，即200%或每克干土壤含2克水。5.为了做到这点，制作了一个半自动的系统：一个天平连接在计算机上利用软件来操作，软件使输入的重量直接进入Excel系统，Excel软件运用一系列的方程计算每个称量的泥炭团中的含水量，最终需水量，所需加水量。每天都需要对泥炭团进行称量，通过计算补充水分，使其维持在田间蓄水量的30%即mDr水平。本实验分为三组：第一组播种后（DAS）25天进行上述处理，第二组播种30天后处理，第三组播种35天后处理。同时三组植物分别表现为：8片叶子10片叶子、12片叶子。6.对累积水分亏缺（pDr）处理，植物也是在上述培养室中培养，播种后35天不给于水分，泥炭团保持干燥，通过称量泥炭团的重量使其达到所需要的累积水分亏缺水平（pDr）。在这项研究中进行两个水平上的测定：萎焉水平和萎焉前一天（萎焉前水平）.7.2.植物生长期生长率的测定如上所述，植物在正常生长条件下生长，然后采摘不同时期的植物测其生物量。第一组播种后25天采摘，第二组播种后30天采摘，第三组播种后35天采摘。这些日期不像上面所述的干旱处理的时间，而是收获的真正时间。两个不同发育时期的生长率：播种后25-30天和播种后30-35天，利用公式计算：相对生长率（RGR）=(lnW2-lnW1)/(t2-t1)生长率通过生物量和叶面积来测定。叶面积,通过扫描干旱处理和水分充足条件下的叶子利用J图像来测定。通过计算相对膨胀率来描述生物量。8.3.中等干旱条件下的脱落酸和JA突变体在我们的中等干旱条件下可以检测到脱落酸缺乏和JA突变体的信号。本实验用到的突变体有abi1(SALK_076309C),蛋白磷酸化酶，引起对ABA不敏感的显性突变coi1(SALK_095916C),对响应茉莉酮酸酯类是必须的jin1(SALK_061267C),jar1(CS8072)inColbackground,腺苷酸形成酶，abi1(CS22),aba1(CS21)inLerbackground玉米黄质环氧化酶，玉米黄质到紫黄质的环氧化，ABA合成的第一步4.气体交换测定在中等干旱条件下对五个时间点进行测定：中等干旱(mDr)处理的-1,0,1,2,3天。气体交换的测定在气体流动率为150μmoles-1,CO2400μmole,湿度为50%.的条件下用LICOR6400XT和拟南芥扩展室来测定。9.5.生化分析干旱条件和水分充足条件下植物进行淀粉分析，对植物在以下不同的时间点采样：干旱处理（ＤＭＤ）的－１，０，１，２，３天水分充足的采样时间点同上。采样在傍晚淀粉积累量达到最高值时进行.采样后将其保存在－８０℃。将每个样本在液氮中研磨成良好的粉末，称重，然后利用酶染色淀粉试剂盒对每个样本进行定量分析。脱落酸的量化即在以下不同的时间点采样：中等干旱处理的第0，1，2天。脯氨酸在中等干旱条件下第3,4天取样，用上述方法进行量化.10.6.基因表达模式分析7.拟南芥后基因芯片—基因探针图谱分析8.启动子分析9.基因功能富集分析10.利用qRT-PCR进行基因表达分析11．植物对适度干旱（mDr）的时间性反应为了研究拟南芥对可控制的土壤水分亏缺性干旱反应，在不同的植物发育时期测定适度干旱（mDr）效果（见图1）。根据控制植物水分的生长时期不同分为三类：播种后25天、播种后30天、播种后35天。这些生长时期相当于在拟南芥的6-叶期、8-叶期、10-叶期停止给植物浇水。12．图2显示了适度干旱（mDr）处理和水分充足条件相比，最高的生物相对减少率是在播种后30天进行干旱处理的植物，播种后25天进行干旱处理的也很明显，播种后35天进行干旱处理对干旱的反应最不敏感（图2A）。拟南芥生态型哥伦比亚植物的生长速率由两个发育时期决定的：播种后25-30天和播种后30-35天。植物的生长速率（生物量和叶面积）在第一发育阶段即播种后25-30天比第二发育阶段播种后30-35天高些。（图2B）由图可以看出干物质积累和叶片扩张明显减慢，生长明显受阻。RB：生物量的相对减少率RGR:相对生长率RER：相对膨胀率DAS：播种后的天数13．LRWC(叶片相对含水量)SWC（土壤含水量）DMD（mDr的处理时间）WW（充足水分条件）DRT（干旱条件）在每个时间点测定植物样本和土壤中的相对含水量（图2C和D）。14．叶子的相对含水量（LRWC）的测量值显示植物在mDr处理前1天开始感知干旱（图2C）.在mDr的第0天（mDr的开始）叶子的相对含水量（LRWC）减少，一直持续到适度干旱处理后1天（图2C和D）。然而，在适度干旱处理后第2天叶子相对含水量（LRWC）开始增加到水分充足条件的正常水平（图2C），土壤含水量从mDr处理后第1天开始直到mDr处理的最后一直保持恒定不变（图2D）。15．激素途径突变体的干旱反应在mDr条件下，敲除ABA信号传送和生物合成反应的基因的突变体在两组拟南芥中被测定。在可控制的适度干旱（mDr）条件下和水分充足的条件下相比，生长的减少量（测定的生物量）为不同的基因型和野生型相比较提供了一个参数，辨别出了对干旱敏感/有抗性的变异的基因型。生物量的相对低减率（RB）=（Ｂｗｗ－BDRT）/BwwBww是充足水分条件下生物量；BDRT是中等干旱条件下生物量。16．RB(生物量的相对减少率)WW（充足水分条件）DRT（干旱处理条件）WT（野生型）ABA信号发送突变体（abil）和生物合成突变体（abal）和各自的野生型相比对干旱胁迫更敏感（图3A.B）。17．茉莉酸反应突变体coil和jinl在mDr处理的第10天显示了显著的干旱抗性（图3C和D）。。其它茉莉酸反应突变体jarl显示了干旱反应表现型但和野生型没有显著的差异。这种茉莉酸突变体的反应和coil和jinl相比更加缓和，可能是因为jarl的等位基因并没有完全敲除而是一种氨基酸置换的突变体.18．对mDr反应的气体交换参数的改变Pn：光合作用gs：气孔导度Ci：内部CO2浓度WW：充足水分条件19．在mDr处理后第1天气孔电导率下降至水分充足条件下的59%（图4A）。在mDr处理前1天和处理的当天气孔电导率降低将近50%（图4A），并且会继续下降直到mDr处理后第2天，大约降低水分充足条件下的40%。在mDr处理后第3天气孔电导率会增加到水分充足水平。内部CO2浓度也表现出同样的趋势（图4A）然而光合作用表现了不同的趋势，mDr处理后第1天没有下降，第2天和水分充足条件的相比下降了10%（图4A）.20．在mDr处理后第1和第2天瞬时水分利用率（WUEi）比水分充足条件下高（图4B），在mDr处理后第1和第2天高于4μmolmmol-1而水分充足条件下瞬间水分利用率大约为2μmolmmol-1，在-1,0,3瞬间水分利用率和水分充足条件下相同。（图4B）WUEi：瞬时水分利用效率WW:充足水分条件DRT:干旱处理条件DMD:中度干旱处理时间21.植物对土壤水分亏缺的转录应答反应的描述为了了解干旱胁迫下基因表达的整体效应，以mDr(第1天和第10天)和累积干旱条件下的小叶片为材料进行了微序列（基因芯片）分析。不同的表达分析显示了在对mDr反应的早期（mDr处理后第1天）很多基因（2039个）都受到了显著地扰乱。然而，在中等干旱胁迫持续了一段时期后（第10天）明显较少的基因（728个）表现出一些反应。通过这些反应相对比，对累积干旱(pDr即萎焉)的反应中基因表达受到了严重的而影响：7648种差异性表达（DE）基因-大约占基因组的30%-全都是已知的压力反应基因和程序。22.首先在基因水平进行这三种反应（mDr处理后第1天，第10天，pDr）的比较（图5）。mDr和pDr处理有178个共同的差异性表达基因（91个上调，87个下调）而mDr处理中有1083个特异的基因（545个上调，538个下调）。23.在mDr处理后第1天和pDr处理中的上调基因是主要的水分缺失反应基因（q-值~1E-15），对ABA刺激(q~1E-12.6),渗透压(q~1E-8.1),寒冷(q~1E-4.1)和氧化(q~1E-2.5)的压力反应的重叠基因。这些基因中其中几个表达动力学已通过qRT-PCR技术被证实。在mDr处理后第1天和pDr的材料中我们已知的被干旱影响的细胞的基本过程包括DNA包装（q~1E2.6）,核糖体的生源（q~1E-2.9）和蛋白质折叠（q~1E-3.2）都被下调。因此，植物具有对mDr的早期反应和对累积水分亏缺的经典反应是相似的。但是，严重的影响包括光合作用基因(q~1E-20.7)下调及相关过程仅限于pDr。24.大部分典型的水分亏缺反应的基因表达在mDr处理后第1天和pDr条件下是上调的，在相似的控制条件下，随着植物生长到持续mDr的第10天其中一些基因甚至被下调（q~1E-2.8）。这些急剧变化的反应很可能是因为植物对持续压力的适应。在这个阶段中，这些上调的基因中有几个激素（ABA）介导的信号发送基因（q~1E-2.1），这些基因可能介导了对环境的适应。硫配糖体（q~1E-4）,IAA-衍生物（q~1E-2.9），JA(q~1E-2.8)和特定的长链脂肪酸（q~1E-2）的新陈代谢基因在mDr处理后第10天都是下调基因。细胞壁增厚涉及到的一些基因（q~1E-2.9）和少数调节细胞生长的基因（q~1E-2.8）只有在mDr处理后第10天和mDrDay10-pDr条件下为下调基因。这些都支持了一般而言持久的水分缺乏阻碍细胞生长的观点。25.干旱反应基因的顺式调节为了鉴定顺势调节因子可能介导已鉴定出来的干旱反应基因的转录调节，我们设计了一个转录因子探索传递途径：（CRE-discoverypipeline）:利用一个脱-新基序探索工具FIRE来发现新的因子，并把这些发现的因子和权威数据库已知的顺式因子作对比，取出顺式调节因子中有意义的序列.分析mDr处理后1天、10天和pDr基因序列（进一步分为上调和下调）的顺式因子传递途径，来鉴定几个已知的和新发现的顺式调节因子（CREs）26.顺式调节因子突显在mDr处理后第1天和pDr的上调基因中，这和实验鉴别的ACGT-包含在ABRE-(ABA响应元件)序列ACGTG(G/T)C中高度相似（见图5）。在pDr-ABRE中位置6(G/T)的简并性恰好保留下来，而在mDrDay01-ABRE中它是严格的T.有趣的是，mDrDay10的下调基因中发现的一个因子和ABRE-A(A/C)(A/C)RCGTG非常相似。27.在mDrDay01的上