2017-5-25-合成生物学

合成生物学(Syntheticbiology)121.人工合成酵母染色体2.人工合成酵母基因组34酿酒酵母简介•酵母（Yeast）是一类种类繁多的生物资源，已知有80个属约600多种，数千个分离株。•酵母是一类单细胞的真核生物。–它有完整的亚细胞结构和控制严密的基因表达调控机制。–它既能通过有丝分裂进行无性繁殖–也可以通过减数分裂实现有性繁殖。5酿酒酵母简介•酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)–又称面包酵母或者出芽酵母–在现代分子和细胞生物学中用作真核模式生物•Morganism–发酵中最常用的生物种类。–细胞为球形或者卵形，直径5–10μm。–同时存在单倍体和双倍体(酵母的优势形态)。6人工合成酵母染色体78酵母人工染色体载体克隆载体的构建YAC载体详述选择标记--Sup4酿酒酵母作表达系统的缺点目录9pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1酵母人工染色体(yeastartificialchromosome，YAC)是一类酵母穿梭载体。YAC具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。此外，YAC还具有酵母菌染色体的一些特点。可以接受100-1000kb的外源DNA片段。酵母人工染色体载体这样的克隆载体在第一受体细胞内可以按质粒复制形式进行高拷贝复制。这种克隆载体在体外与目的DNA片段重组后，转化第二受体细胞，可在转化的细胞内按染色体DNA复制的形式进行复制和传递。10筛选第一受体的克隆子，一般采用抗菌素抗性选择标记；筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补的营养缺陷型。人工酵母染色体克隆载体的构建YAC(酵母人工染色体)克隆载体是最早构建成功的人工染色体克隆载体。将酵母染色体DNA的端粒(TEL)、DNA复制起点(ARS)和着丝粒(CEN)以及必要的选择标记(HISA4和TRPl)基因序列克隆到大肠杆菌质粒pBR322中，构建成YCA克隆载体。1112•主要结构：①两个可在酵母菌中利用的选择基因，URA3和TRP1(色氨酸合成基因)；②酵母菌着丝粒序列(centromere4,CEN4)；③一个自主复制序列(ARS1)；④两个来自嗜热四膜虫(Tetrahymennathermophilp)的末端重复序列(TEL)，以保持重组YAC为线状结构；YAC载体--pYAC413⑤在两个末端序列中间，有一段填充序列(HIS3)，以便pYAC4在细菌细胞中稳定扩增；⑥Amp抗性及细菌质粒复制原点；⑦一个EcoRⅠ克隆位点，该位点位于酵母菌Sup4tRNA基因内。14•Sup4基因编码赭色抑制Trp-tRNA，抑制赭色表型(成为白色)。•不含外源DNA片段的pYAC4载体转化酵母菌，转化子的菌落呈白色。•带有插入的外源DNA片段的pYAC4重组载体，其Sup4已经失活，结果转化酵母菌后所产生的转化子形成赭色菌落。选择标记--Sup415•一般酵母表达载体都以大肠杆菌质粒为基本骨架再加上酵母的自主复制序列，选择标记，外源基因插入位点，启动子和终止子。•既能在酵母菌中复制也能在大肠杆菌中复制，所谓酵母菌—大肠杆菌穿梭载体。16YAC载体首先用EcoRI和BamHI双酶切割，获得均具BamHI和EcoRI切割末端的两个DNA片段(双臂)，随后把两端具EcoRI切割末端的外源DNA与此双臂连接，构成酵母人工染色体。用电激仪把此人工染色体转化酵母受体细胞。17酿酒酵母作表达系统的缺点在YAC载体中的插入片段会出现缺失和重排的现象。容易形成嵌合体。即在单个YAC中的插入片段由2个或多个独立的基因片段连接组成的现象。YAC染色体与宿主细胞的染色体大小相近，YAC染色体转入酵母细胞后很难从中分离出来。“Perfect”designerchromosomeVandbehaviorofaringderivativeScienceVolume355(6329):eaaf4704March10,2017人工合成酵母基因组18SyntheticYeast2.0•Buildingtheworld‘sfirstsyntheticeukaryoticgenometogether！Dr.JefBoeke1920目录synV设计原理人工设计基因组原则PCRTags引入新序列Cre-LoxP重组酶系统组装synV设计原理21synV设计期间的主要编辑包括删除两个亚端粒区域，20个tRNA基因，30个转座子/Ty元件和10个内含子，并插入176个loxPsym位点;额外的基因变化包括62个TAG/TAA终止密码子互换和339个同义重新编码，以引入源自天然染色体V的PCRTag人工设计基因组原则Elements删除换位替换引入不变逆转录转座子tRNA基因将TAG替换为TAALoxPSymsitesGeneorder端粒重复部分部分同义密码子替换NoncodingregionsPCRTags内含子•利用密码子简并性实现基本理念：优化基因组，减少不稳定和冗余结构Isaacs,F.J.etal.Precisemanipulationofchromosomesinvivoenablesgenomewidecodonreplacement.Science333,348–353(2011).2223（1）通过综合共转化策略进行多重变异修复（2）通过综合共转化策略成功校正变体的实例。通过单个共转化过程，用loxPsym位点替换tRNA基因和内含子;引入新序列•在每个非必需基因前后加入了特殊序列–LoxPSymsites•Cre-LoxP重组酶系统–特异性删除某特定序列的技术–在新型基因打靶中获得广泛应用，是条件性基因打靶、诱导性基因打靶、时空特异性基因打靶策略的技术核心。Cre-LoxP重组酶系统Cre重组酶于1981年从P1噬菌体中发现，基因编码区序列全长1029bp。一种位点特异性重组酶，能介导两个LoxP位点（序列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组24Cre-LoxP重组酶系统•Cre-LoxP重组酶系统–LoxP（locusofX-overP1）序列：•来源于P1噬菌体•有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。•13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。•Cre-LoxP重组酶系统–如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。25PCRTagsPCRTag分析是确保synV并入成功的主要支柱。选择具有正确的营养缺陷型和与野生型菌株（BY4741）相似的适应性的中间菌株用于基因组DNA（gDNA）提取和PCRTag分析。PCRTag的开放阅读框（ORF）内的短重新编码序列促进了基于聚合酶链反应（PCR）的测定法，以区分野生型与合成DNA。26模板1模板2F1R1PCR片段AF2R2片段BPCR无引物PCR互为模板、引物延伸F1R2延伸PCR目的片段搭桥PCR的原理示意图小片段组装大片段27利用酵母自身的同源重组系统将小片段组装成大片段利用大片段之间的重叠区域和同源臂可以将多个大片段同时替换大片段的天然染色体组装、整合28敢想、敢做、能做！Nothingisimpossible!29